Participación de la conjugación de SUMO en la biogénesis de los ARN pequeños nucleares - Bragado, Laureano Fabián Tomás (2022)
Los ARN pequeños nucleares (snRNAS) son moléculas de ARN no codificantes, de menos de 350 nucleótidos, ricos en uracilos, que se asocian con un gran conjunto de proteínas formando ribonucleopartículas pequeñas nucleares conocidas como “snRNPs”. Las funciones biológicas de los snRNAs están bien caracterizadas desde hace años. Los snRNAs U1, U2, U4, U5 y U6 forman las partículas snRNPs que llevan el mismo nombre y que se ensamblan para dar lugar al spliceosoma “mayor”, mientras que U11, U12, U4 atac, U6 atac juntos con U5 participan de la conformación del spliceosoma “menor” o minoritario. Por su parte, el snRNA U7 es requerido para el procesamiento de los pre-ARNm que codifican para las histonas no replicativas y el U3 es necesario para el procesamiento del ARN ribosomal. El snRNA 7SK es responsable de regular los niveles activos de p-TEFb, un complejo quinasa responsable de fosforilar a la ARN polimerasa II. La ARN polimerasa III es la responsable de transcribir a U6, U6 atac y 7SK, mientras que la ARN polimerasa II transcribe los restantes snRNAs. Teniendo en cuenta la relevancia de los snRNAs para la formación del spliceosoma y consecuentemente para el proceso de splicing, que la regulación de la expresión de estos ARNs no codificantes es aún escasamente comprendida, así como también trabajos previos de nuestro laboratorio que demostraron la importancia de la conjugación de SUMO (o “SUMOilación”) para el ensamblado y actividad catalítica del spliceosoma, decidimos explorar una posible conexión entre la maquinaria de SUMO y la biogénesis de los snRNAs transcriptos por la ARN polimerasa II. Hemos hallado que disminuir la SUMOilación global en células en cultivo, mediante la sobre-expresión de distintas SUMO proteasas, altera los niveles de snRNAs nacientes (no procesados). Además, pudimos identificar que diversas proteínas que forman parte de los complejos reguladores de las diferentes etapas de la biogénesis de los snRNAs son blanco de conjugación de SUMO. Nos enfocamos en dos de estas proteínas: SNAPC1, un factor de transcripción específico de snRNAs que pertenece al complejo SNAPc; y la proteína INTS11, subunidad responsable del procesamiento 3’ de los snRNAs nacientes dentro del complejo Integrator. En el caso de SNAPC1, observamos que al mutar las lisinas 245 y 333 disminuye drásticamente su conjugación a SUMO y esta proteína mutante deficiente de SUMOilación (SNAPC1 K245/333R) es incapaz de activar la transcripción de U1 y U2, a pesar de no tener alterado su reclutamiento a los promotores correspondientes. Esto indicaría que la SUMOilación de SNAPC1 es necesaria para que pueda ensamblarse el complejo SNAPc o bien para que este complejo reclute a los factores generales de la transcripción. Además, observamos que en ciertas líneas celulares en cultivo, la sobre expresión de dicha mutante lleva a la muerte celular. Esto podría deberse a alguna tolerancia diferencial a las alteraciones en los niveles de snRNAs. En el caso de INTS11, mediante mutagénesis dirigida pudimos determinar que las lisinas 381, 462 y 475 son blancos de conjugación de SUMO. Observamos que una versión triple mutante de esta proteína, INTS11 K381/462/475R o “3KR”, es incapaz de clivar transcriptos nacientes de snRNAs, a diferencia de la versión salvaje. Además, INTS11 3KR tiene alterada su interacción con algunas subunidades del complejo Integrator, pero no con aquellas que conforman el módulo catalítico (INTS4/INTS9/INTS11). Estos resultados sugieren que la SUMOilacion de INTS11 no participa en el ensamblado del módulo catalítico, pero es necesaria para la conformación de todo el complejo Integrator. Por otro lado, encontramos que INTS11 3KR presenta una localización sub-celular más citoplasmática que la versión salvaje. Se ha postulado al complejo Integrator como un complejo modular que se va ensamblado en forma co-transcripcional. Nuestros resultados nos llevan a proponer que el módulo catalítico se encuentra pre-ensamblado y que podría hallarse como tal en el citoplasma. Los resultados presentados muestran la relevancia de la SUMOilacion en la biogénesis de los snRNAs, tanto en el inicio de la transcripción como en el procesamiento 3’ de dichos transcriptos.