Actividad inhibitoria de compuestos reactivos contra motivos Zn-fingers sobre la infección con arenavirus

• Autores: García, Cybele Carina
• Año de publicación: 2004
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Damonte, Elsa Beatriz
• Materia: ARENAVIRUS; VIRUS JUNIN; VIRUS TACARIBE; VIRUS DE LA CORIOMENINGITIS LINFOCITARIA; ACTIVIDAD ANTIVIRAL; ACTIVIDAD VIRUCIDA; INHIBIDORES ZN-FINGER; COMPUESTOS AZOICOS; COMPUESTOS DISULFUROS; ARENAVIRUS; JUNIN VIRUS; TACARIBE VIRUS; LYMPHOCYTIC CHORIOMENINGITIS VIRUS; ANTIVIRAL ACTIVITY; ZN-FINGER INHIBITORS; AZOIC COMPOUNDS; DISULFIDES COMPOUNDS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Los virus de la familia Arenaviridae incluyen patógenos humanos causantes deseveras fiebres hemorrágicas, como los virus Lassa (LASV)y Junín (JUNV). Laproteína Z de los arenavirus, posee un motivo RING finger altamente conservadoentre los distintos arenavirus, necesario para la interacción con proteínas celularesy virales, y por lo tanto es un punto de ataque ideal para la quimioterapia antiviralcontra las fiebres hemorrágicas. El objetivo del presente trabajo fue estudiar laactividad inhibitoria de compuestos electrofílicos reactivos con motivos Zn fingers.provistos por el National Cancer Institute (USA), comprobar que Z es el blanco deacción de dichos compuestos y demostrar que su rol es esencial en el ciclo demultiplicación viral. Los compuestos, que incluyeron disulfuros alifáticos yaromáticos, derivados azoicos e hidrazidas fueron inicialmente evaluados por sucapacidad inhibitoria sobre la infección de células Vero contra los arenavirus JUNVy Tacaribe (TCRV). De un total de 15 compuestos ensayados, 2 presentaronsimilar eficacia en sus propiedades antivirales y virucidas, 6 presentaron unaactividad virucida superior a su efecto antiviral, 3 fueron estrictamente antivirales, 1 ejerció únicamente acción inactivante y 2 fueron inactivos. Los compuestosinactivantes mostraron ser efectivos también contra el virus de la coriomeningitislinfocitaria (LCMV), arenavirus prototipo de la familia. El análisis de los parámetros (tiempo y temperatura) que afectan la inactivación de JUNV y TCRV, demostróque la cinética de inactivación es rápida y que la reacción es dependiente de latemperatura, ya que no hubo inactivación del virus a 4°C. La interacción entre elvirus y el compuesto inactivante lleva a un bloqueo del ciclo de multiplicación virala nivel de la transcripción y replicación, ya que el mismo se adsorbe y penetra enlas células con igual eficacia que el virus control, pero no se detecta RNAcorrespondiente a los genes N, GPC y Z, en los viriones inactivados. Este hechose verificó por la ausencia total de síntesis de proteínas virales cuando se infectancélulas con virus inactivado. Sin embargo, los viriones inactivados mantienen lafuncionalidad de las proteínas externas, ya que se observaron títulos comparablesde anticuerpos neutralizantes en animales inoculados con viriones inactivados conrespecto a los inoculados con JUNV y TCRV infecciosos, indicando así lapreservación de la capacidad antigénica de las glicoproteínas luego deltratamiento inactivante. La acción diferencial de estos agentes sobre HSV-1 y losarenavirus confirma que la proteína Z de los arenavirus juega no sólo un rolregulatorio durante el ciclo viral, sino que tiene también importancia estructural, yaque los compuestos ejercen su acción tanto en la célula infectada, comodirectamente sobre el virión.Los resultados del estudio del efecto inhibitorio sobrela proteína Z purificada de LCMV y LASV, indicarían que los compuestos estándirigidos particularmente hacia la proteína Z de los arenavirus, interaccionandocon ella y provocando su multimerización, con la consiguiente pérdida defuncionalidad y capacidad infectiva del virión. Por otro lado, se sabe que lainfección con LCMV conduce a la recolalización de cuerpos nucleares de laproteína celular con homeodominios ricos en prolina (PRH) al citoplasma de lacélula infectada. En células infectadas con LCMV se observó que el tratamientocon NSC20625 inhibe la replicación del RNA viral, sin afectar la transcripción delgen celular prh. Además, el tratamiento con NSC20625, no sólo inhibió laexpresión de la proteína viral Z en las células infectadas con LCMV, sino queademás revirtió el patrón de distribución de la proteína PRH al patrón de PRHobservado en células normales. Por último, el compuesto azoico ANNB mostró unamplio rango de acción contra los arenavirus, ya que fue también inhibidor de lamultiplicación de otras cepas de JUNV, asi como de TCRV, Pichinde y LCMV. Elestudio del modo de acción antiviral manifestó que el ANNB afecta las etapastardías del ciclo de multiplicación viral; esto se comprobó al observar que ni lasetapas tempranas de adsorción e internalización viral, ni la síntesis y expresión deproteínas virales estaban afectadas. La producción de virus asociado a célulasestá igualmente afectada que el virus extracelular, por lo que el ANNB estaríabloqueando el correcto ensamblado dentro de la célula. Estos resultados demuestran por primera vez que una proteína esencial para losarenavirus es el blanco de acción de compuestos que representan agentesantivirales promisorios contra estos patógenos, mostrando similar eficacia in vitroque la ribavirina, la única droga conocida que ha sido ensayada en los pacientesinfectados con arenavirus.
The Arenaviridae family includes several human pathogens like Lassa virus (LASV) and Junín virus (JUNV) causing hemorrhagic fevers. The Z protein ofarenavirus presents a highly conserved RING finger motif which turns this proteinan attractive target for antiviral therapy. In the present study, we have evaluatedfifteen selected Zn fingers reactive compounds, provided by the National Cancer Institute, for their capacity to act as inhibitors of arenavirus infection. From the totalof compounds evaluated against JUNV and Tacaribe (TCRV), 2 presented similareffectiveness in their antiviral and virucidal properties, 6 presented a virucidalactivity superior to the antiviral effect, 3 were exclusively antivirals, 1 exerted onlyvirucidal action and 2 were totally inactive. The virucidal compounds demonstratedto be effective also against the Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV). Thetime course of virucidal activity showed that the inactivation started a few minutesafter addition of the compound to the virus suspension and proceeded in a time dependentmanner. Arenavirus inactivation was also energy-dependent since atemperature higher than 30°C was required to destroy virus infectivity. The mode ofinactivation of these compounds rendered non-infectious virus particles butpreserving the conformational integrity of the virion glycoproteins. This conclusionwas supported by the following results: binding of inactivated virions to cellularreceptor was performed with the same efficacy as native virions; internalization viafusion between viral and endosome membranes was not affected in inactivatedvirions; after inoculation of adult mice with 10 4 PFU of either JUNV and TCRVcontrol or treated virus with NSC20625, comparable levels of antibodies weredetected indicating that the inmunogenecity of viral glycoproteins was preserved. Inorder to further understand the antiviral mechanism we studied the transcriptionand replication of inactivated JUNV virions on Vero cells by detection of the N, GPC and Z genes. No amplification products were detected, demonstrating ablockade in viral transcription. The differential inhibitory action observed againstarenavirus and HSV-1 confirmed that Z is playing structural and regulatory rolesduring the multiplication cycle. These zinc finger inhibitors were reported toestablish disulfides linkages between zinc finger motifs in proteins. The resultsobtained after investigating the extent of Z multimer formation exhibited significantaltered patterns showing high-molecular-weight multimers, suggesting theestablishment of inter-and possibly intramolecular disulfide bonds, leading to theformation of Z multimers. It has been reported that LCMV gene expression andreplication affect the subcellular localization of PRH in human hepatocytes and thatthe PRH protein can be physically associated with the arenavirus Z protein. It wasobserved that the treatment with NSC20625 of LCMV infected-cells inhibited thereplication of the viral RNA, without affecting the transcription of the cellular geneprh. The NSC20625 treatment, not only inhibited the expression of Z viral protein in LCMV infected-cells, but in addition, reverted the distribution pattern of PRHprotein in these treated cells to the observed pattern of PRH in normal cells. On theother hand, the azoic compound ANNB showed a broad spectrum of action againstarenavirus, since it was also inhibitor of the multiplication of several strains of JUNV, as well as of TCRV, Pichinde and LCMV. The mode of action showed that ANNB affects late stages of the viral multiplication cycle; this was verified whenobserving that neither the early stages of adsorption and internalization, nor theviral protein synthesis and expression were affected. The production of associatedvirus to cells was affected, so the ANNB would be blocking the correct assemblywithin the cell. The present work demonstrate for the first time that an arenavirus protein is thetarget of compounds that represent a promising class of agents against highlypathogenic arenaviruses showing similar effectiveness in vitro to the ribavirin, theonly well-known drug that has been used in patients with hemorrhagic feverscaused by arenavirus.
Fil: García, Cybele Carina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.