Estudios sobre el metabolismo, la estructura y el mecanismo de síntesis del glucógeno de alto peso molecular - Parodi, Armando José (1970)
A) PRIMERA PARTE Influencia sobre la distribución de pesos moleculares del gno hepático de factores que modican el contenido total de gno Se estudia la posible influencia que pudiesen tener en la distribución de pesos moleculares del gno particulado hepático de ratones, distintos factores que modifican el contenido total de gno. Como agentes glucogenolíticos se estudian: ayuno, isquemia, inyección de epinefrina, glucagón e insulina. Se encuentra que si bien estos agentes disminuyen el contenido de gno, el P.M. de éste sufre solo una muy ligera disminución. Como agentes glucogenogénicos se estudian: administración de glucosa e hidrocortisona. En el primer caso la distribución de P.M. no experimentó prácticamente ninguna variación con grandes aumentos en el contenido de gno. Lo que realmente aumentó es el número de moléculas y no el P.M. de éstas. En el segundocaso (hídrocortisona), se comprueba que el gnosintetizado gluconeogénicamente por influencia de esta hormona no difiere en cuanto a su P.M. del de un animal con alimentación normal y no inyectado con hidrocortisona. Tampoco influye en el P.M. del gno particulado la administración de hormona de crecimiento bovina ni de distintos monosacáridos (glucosa, fructosa o galactosa) como precursores del polisacárido. Se discuten estos resultados teniendo en cuenta tanto las propiedades de las enzimas que se suponen actúan "in vivo" en la síntesis y degradación el gno así también como la localización de éste en el hepatocito y en el lobulillo hepático. B) SEGUNDA PARTE Estudios sobre la estructura del gno particulado Mordoh et al (63) postularon la existencia en el gno particulado hepático de uniones más lábiles al ácido, álcali, calor, etc. que las glucosídicas comunes α1-4 y α1-6 y que uniría particulas de P.M. 8 millones (Coeficiente de Sedimentación (S) = 100). Dicha unión estaría ausente en el gno sintetizado "in vitro" por los mismos autores (65) a partir de G-1-P, usando como enzimas a la fosforilasa b de músculo cristalino y la ramificante de hígado parcialmente purificada (gno-G-1-P). No sólo la velocidad sino también el mecanismo de ruptura acídica resultó distinto ya que el nativo se rompía dando preferentemente moléculas de S=100 mientras que el gno-G-1-P se rompía por mitades. En este trabajo se estudia la posible naturaleza de esta "unión lábil" del gno nativo. Se encuentra que la ruptura del gno nativo y la del gno-G-1-P son afectadas de igual manera por distintos buffers. También la curva de estabilidad versus pH es similar para ambas muestras. Las velocidades de ruptura de los dos gnos son afectadas de igual manera por distintos cationes. Se estudia la velocidad de ruptura en ClH 0,l N a distintas temperaturas y se determina la energía de activación para la ruptura de los gnos nativo y gno-G-1-P en dichas condiciones. Se comprueba que los mecanismos de degradación de los dos gnos en diferentes condiciones (NaOH 0,l N a 100° C; Tetraborato de Sodio 0,l M pH 9,0 100° C; NaOH 0,l N-Urea 8 M l00° C) son similares a sus respectivos mecanismos de ruptura acídica descriptos por Mordoh et al (63). El mecanismo de ruptura por sonicación en cambio, es el mismo para ambas muestras. Se comprueba que las uniones rotas por las ondas sónicas son distintas a las que afecta la católisis ácida o básica. Se mide la estructura "primaria" (% de ramificación, longitud de ramas externas) del gno particulado hepático y del gno-G-1-P y se observa que son iguales. Se encuentra también que las dextrinas de β-amilasa del gno nativo son mucho más estables al ácido que muestras de gno de igual P.M. pero el mecanismo de ruptura es similar para ambos. Se extrae gno de hígado de aves y anfibios y se comprueba que es particulado y que posee la "unión lábil" inicialmente descripta para el hígado de rata. El gno de músculo esquelético de rata en cambio resulta no ser particulado. Se observan a los gnos nativo y gno-G-1-P al microscopio electrónico y se ve que en el segundo las subpartículas están más juntas y peor definidas que en el primero. Se consigue sintetizar “in vitro" gno particulado usando su precursor natural (UDPG) y las enzimas glucógeno sintetasa y ramificantes ambas hepáticas y parcialmente purificadas. Este glucógeno (gno-UDPG) presenta una labilidad al ácido y al álcali igual a la del nativo de hígado y distinta a la del gno-G-1-P. Los mecanismos de rutura ácida y alcalina del gno-UDPG y del nativo hepático son también similares. Por distintos experimentos se descartan las posibilidades de que el gno-UDPG sea un agregado formado por enredamiento de las moléculas mientras estas crecen o por interacción entre las proteínas de la mezcla de incubación y las partículas de gno. Se discuten los resultados obtenidos y se concluye que la "unión lábil" del gno nativo es una unión glucosídica común α1-4 o α1-6 cuya labilidad está aumentada en el gno nativo por factores estéricos. C) TERCERA PARTE Estudios sobre el mecanismo de síntesis "in vitro" de gno particulado En el curso de los experimentos descriptos en la segunda parte se encontró que el gno-UDPG posee un P.M. muy superior al del gno-G-1-P si ambas muestras son sintetizadas en iguales condiciones. Se estudian las posibles causas de este hecho. Se encuentra que cuando se sintetiza gno-G-1-P con gno-KOH radiactivo como primer, existe un desplazamiento entre las curvas de gno y de radiactividad. Además el P.M. del gno-G-1-P resultó ser menor al que se puede predecir teóricamente para poblaciones monodispersas. Estos resultados se pueden explicar admitiendo una transferencia preferencial de glucosa a las moléculas de gno de menor P.M. Esto está de acuerdo con mediciones de la Km de la fosforilasa b para el gno. Diversos autores han encontrado que el Km de la fosforilasa es menor para un gno liviano que para uno pesado. El P.M. del gno-UDPG resultó ser mucho mayor que el predicho teóricamente para poblaciones monodispersas. Si se lo sintetiza con gno-KOH radiactivo como primer, se encuentra que la mayoría del primer queda con su P.M. sin modificar, es decir no utilizado por la sintetasa. Por varios experimentos se determinó que la pequeña parte de primer utilizada es crecida sin que haya transferencia preferencial de glucosa por parte de la gno sintetasa hacia moléculas de gno de distinto P.M. No se consigue explicar el porqué la gno sintetasa no utiliza a todo el primer. Se descarta la posibilidad de que esto se deba a una unión muy fuerte entre la enzima y ciertas moléculas de primer o a la presencia de trazas de α-amilasa en las mezclas de incubación, de manera que las moléculas de gno por ella atacadas no fuesen capaces de aceptar glucosas del UDPG. La distinta especificidad de las dos enzimas transferentes respecto al P.M. del gno y la no utilización total del primer por parte de la sintetasa podrían explicar bien la diferencia de P.M. del gno-UDPG y del gno-G-1-P sintetizados en iguales condiciones. Sin embargo la existencia de una agregación específica entre las moléculas de gno-UDPG durante la síntesis es una hipótesis muy probable de ser real. No se encontró ninguna relación entre el P.M. final del gno-UDPG y la cantidad de primer utilizado por la sintetasa. Los experimentos que más apoyan esta idea de una agregación específica son aquellos en los cuales se estudió el cambio en la distribución de P.M. del gno-UDPG y del gno-G-1-P durante la síntesis. Se encontró que en el primer caso de una población inicial liviana, se obtiene luego de un tiempo de síntesis dos poblaciones, una liviana y otra mucho más pesada. Existen ciertas evidencias que indicarían que la población pesada se forma por agregación de las moléculas livianas. En el segundo caso, esto es en la síntesis de gno-G-1-P se observa durante todo el transcurso de la síntesis una sola población que se va haciendo más pesada a medida que transcurre el tiempo de incubación. De acuerdo a los resultados encontrados en la segunda parte de la tesis, el gno de músculo de rata no es particulado sino que es mucho más liviano que el de hígado. Se consiguió sintetizar gno-UDPG por la gno sintetasa de músculo. El P.M. de este gno sintético resultó ser solo levemente mayor que el del nativo de músculo. No se observó ningún cambio apreciable en la actividad enzimática cuando se guardó a la preparación de gno sintetasa muscular a -20° C, durante varias semanas. Sin embargo la enzima envejecida resultó ser capaz de sintetizar gno de alto P.M. Este gno-UDPG pesado resultóser indistinguible del gno-UDPG sintetizado por la gno sintetasa hepática o del gno nativo de hìgado a juzgar por la distribución de P.M. y por la acción del ClH 0,1 N a temperatura ambiente. Se encontró que la gno sintetasa muscular fresca utiliza a todo el primer mientras que la envejecida no lo hace. Esta última se parece a este respecto a la gno sintetasa hepática. Se encontró que la presencia de Sulfato de Amonio 0.25 - 0,35 M en las mezclas de síntesis de gno por la gno sintetasa muscular envejecida inhibe la formación de gno de alto P.M. pero no la síntesis total de gno. Esta inhibición de la particulación no se debe a una mayor utilización del primer por la sintetasa envejecida. Sorprendentemente, la enzima fresca en presencia de sulfato de amonio sintetiza un gno aún más liviano que en su ausencia, a pesar de que con la sal no utiliza todo el primer lo que sí hace sin ella. El efecto del sulfato de amonio sobre P.M. del gno-UDPG sintetizado por la gno sintetasa hepática es mucho menor que sobre el gno sintetizado por su similar muscular envejecida. Los cambios en la distribución de P Consulte el resumen completo en el documento.