Caracterización de la proteína Hsp90 y co-chaperonas de Toxoplasma gondii y su papel en el desarrollo del parásito - Echeverría, Pablo C. (2006)
Toxoplasma gondii es una parásito intracelular obligado y un patógeno humano de importancia. Dos formas replicativas son la característica principal del ciclo asexual de éste parásito: uno de replicación rápida (el taquizoito) y otro de división lenta (los bradizoitos enquistados). El proceso que permite la interconversión entre taquizoitos y bradizoitos es central para la patogenicidad y duración de la infección. Todavía no están claramente comprendidos los mecanismos que regulan este proceso de diferenciación. La inducción del desarrollo del estadío bradizoito in vitro se asocia con varios tipos de estresores, estímulos que son conocidos también como inductores de la expresión de proteínas de choque térmico (HSPs). Las HSPs son un enorme grupo de proteínas que se asocian en forma transiente con intermediarios de plegado de proteínas nacientes o también con proteínas desnaturalizadas, con el objeto de evitar la agregación. In vivo, la proteína Hsp90 tiene un rol fundamental en la maduración de componentes de numerosas vías de transducción de señales. El objetivo de esta tesis fue identificar factores asociados con la diferenciación del parásito. Nuestros estudios se centraron en el análisis del perfil de expresión y la regulación durante el desarrollo de la proteína Hsp90 de T. gondii en tres tipos de parásitos, la cepa RH ΔUPRT, la cepa cistogénica ME49 y un clon derivado de esta última, PK todas útiles para estudios de diferenciación in vitro. Nuestros resultados muestran que el transcripto y nivel proteico de Hsp90 se ven incrementados ante condiciones de estrés y de diferenciación del parásito a bradizoíto. Estudios de microscopía confocal e inmunofluorescencia revelaron que la proteína Hsp90 está presente en el citoplasma de taquizoitos y en el citoplasma y núcleo de bradizoitos maduros, lo cual, sugiere una correlación entre la localización subcelular y los dos estadios asexuales de desarrollo. Para caracterizar el papel de la proteína Hsp90 en la diferenciación a bradizoíto, se estudiaron mutantes de T. gondii incapaces de desarrollar a bradizoitos. Bajo condiciones de diferenciación a bradizoitos éstos parásitos mostraron un patrón de localización celular equivalente al observado en taquizoitos. Se utilizó una droga capaz de unirse e inhibir la función de Hsp90, la geldanamicina, la cual, bloqueó la conversión de taquizoito a bradizoíto y también el camino inverso. Estos resultados sugieren un papel crucial para la proteína Hsp90 durante el cambio de estadío. Se sabe, a partir de estudios realizados sobre la maduración de los receptores de esteroides, que la proteína Hsp90 no actúa sola, sino, que lo hace en asociación con variadas co-chaperonas (Hip, Hsp40, Hop, P23). Estas proteínas se unen a la proteína Hsp90 y se organizan en sub-complejos discretos, cada uno conteniendo un grupo diferencial de co-chaperonas. En el genoma de T. gondii pudimos encontrar varias co-chaperonas pertenecientes a la extensivamente estudiada, “maquinaria” chaperona de las proteínas Hsp90/Hsp70. Se clonaron las proteínas Hip y P23, las cuales, una vez expresadas nos permitieron obtener anticuerpos policlonales que las reconozcan. Por ensayos de co-inmunoprecipitación se pudo determinar que Hip y P23 interactúan con la proteína Hsp90. Ambas co-chaperonas colocalizan intracelularmente con Hsp90 en el estadío taquizoito. En el estadío bradizoito solamente P23 colocaliza con Hsp90, manteniéndose Hip excluida del núcleo. También se clonaron y caracterizaron preliminarmente las co-chaperonas Hop y Hsp40.