Estudio de la endocitosis y señalización mitogénica y metabólica de las dos variantes de splicing del receptor de insulina

• Autores: Giudice, Jimena
• Año de publicación: 2011
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Jares-Erijman, Elizabeth Andrea; Coluccio Leskow, Federico
• Materia: INSULINA; RECEPTOR DE INSULINA; ISOFORMAS; ENDOCITOSIS; SEÑALIZACION METABOLICA; SEÑALIZACION MITOGENICA; MICROSCOPIA CONFOCAL; QUANTUM DOTS; MICROSCOPIA DE FUERZA ATOMICA; INSULIN; INSULIN RECEPTOR; ISOFORMS; ENDOCYTOSIS; METABOLIC SIGNALING; MITOGENIC SIGNALING; CONFOCAL MICROSCOPY; QUANTUM DOTS; ATOMIC FORCE SPECTROSCOPY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La señalización por insulina comprende una compleja cascada de eventos que llevan a la regulación del metabolismo de la glucosa y al crecimiento celular. Fallas en la respuesta a insulina conducen a diabetes mientras que en ciertos tipos de cáncer se encontraron aumentos en la actividad de esta vía se señalización. En mamíferos el gen del receptor de insulina (IR) adquirió un exón adicional junto con la capacidad de procesarlo alternativamente originando dos isoformas, IR-A e IR-B. En esta tesis se presenta el desarrollo de herramientas que permitieron visualizar procesos celulares in vivo por técnicas de microscopía. Esto permitió estudiar la endocitosis de las dos isoformas del IR en células individuales en respuesta a insulina y al factor de crecimiento similar a la insulina II (IGF-II). Una mayor internalización para el IR-A que para el IR-B en respuesta a ambos ligandos fue demostrada. Esto condujo a estudiar la señalización río abajo del receptor observando que la insulina desencadena una cascada mitogénica a través del IR-A y una predominantemente metabólica a través del IR-B. Cuando el estudio se extendió al IGF-II, pudo mostrarse que un mismo receptor sea mitogénico (IR-A) o metabólico (IR-B) se comporta diferente en respuesta a un ligando mitogénico (IGF-II) o metabólico (insulina). La existencia de los híbridos IR-A/IR-B en la membrana fue estudiada generando una quimera del IR capaz de ser modificada extracelularmente y que actúa como dominante negativo selectivo del efecto mitogénico. Esto permitió detectar los dímeros en membrana, analizar su formación y estudiar la señalización diferencial de cada isoforma. Por microscopía de fuerza atómica se midió la interacción molecular entre la insulina y cada IR mostrando que la misma es mayor para el IR-A. Se propone a la dinámica de internalización como el mecanismo responsable de la señalización diferencial de las dos isoformas del IR en respuesta a un mismo ligando. Se plantea un modelo de activación diferencial donde el IR-A se activa más y de forma más sostenida internalizándose más rápido, activando así la vía mitogénica desde los endosomas. Por otro lado, la isoforma B se internaliza de forma más lenta, permitiendo mayor señalización desde la membrana, reclutando moléculas efectoras de esta vía, gatillando la fosforilación de Akt, regulando la actividad de enzimas metabólicas.
Insulin signalling comprises a complex cascade of events playing a key role in the regulation of glucose metabolism and cellular growth. Failures in its function lead to diabetes and disregulations of these pathways were described in many cancer types. In mammals, the insulin receptor (IR) gene acquired an additional exon together with the ability to alternatively skip it in a developmental and tissue-specific manner leading to two isoforms, IR-A and IR-B. This thesis presents the design and development of different tools which allow the visualization of cellular processes in vivo by microscopy. This strategy allowed the study of endocytosis in individual cells after insulin and insulin like growth factor II (IGF-II) binding. The quantitative study revealed a higher rate of endocytosis of IR-A than IR-B induced by both ligands. These differences leaded to study the downstream signaling. It was possible to demonstrate that insulin triggers a mitogenic cascade via IR-A and a more metabolic signaling through IR-B. The study of IGF-II showed that each receptor behaves differently upon activation by a mitogenic ligand (IGF-II) or a metabolic one (insulin). The existence of IR-A/IR-B hybrids in the plasma membrane was studied in this thesis by the generation of an IR chimera that could be modified at the cell surface. This chimera showed behaviour of a selective dominant negative of the mitogenic effect. It was possible to detect the dimers in the plasma membrane, analyze their formation and study the isoform differential signaling. Atomic force microscopy was used to measure the molecular interaction between each IR and insulin. Single molecule force spectroscopy showed that interaction of insulin with IR-A is stronger than with IR-B. This thesis proposes the internalization dynamics as a responsible mechanism for the differential signaling of IR isoforms. By this model, IR-A gets activated and internalized faster triggering mitogenic cascade from the endosomes. On the other hand, IR-B is internalized in a slower manner allowing a higher signaling from the membrane, recruiting effector molecules, triggering Akt phosphorylation, regulating metabolic enzymes and GLUT4 translocation to the plasma membrane.
Fil: Giudice, Jimena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.