Rol del ácido retinoico durante la neurogénesis primaria de Xenopus Laevis

• Autores: Franco, Paula Gabriela
• Año de publicación: 2002
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Carrasco, Andres
• Materia: ACIDO RETINOICO; RA; NEUROGENESIS; INDUCCION NEURAL; HIBRIDIZACION IN SITU; XENOPUS LAEVIS; DESARROLLO EMBRIONARIO; PLACA NEURAL; DIFERENCIACION CELULAR; SONIC HEDGEHOG; RECEPTOR DE ACIDO RETINOICO; RAR; DOMINANTE NEGATIVO; SOBREEXPRESION; OLIGOS MORFOLINOS; RETINOIC ACID; RA; NEUROGENESIS; NEURAL INDUCTION; IN SITU HIBRIDIZATION; XENOPUS LAEVIS; EMBRYO DEVELOPMENT; NEURAL PLATE; CELLULAR DIFFERENTIATION; SONIC HEDGEHOG; RETINOIC ACID RECEPTOR; RAR; DOMINANT NEGATIVE; OVEREXPRESSION; MORPHOLINO OLIGOS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El primer paso para la construcción del sistema nervioso de los vertebrados es laformación de la placa neural. Varios reportes sugieren que la señal retinoide esesencial para el establecimiento normal del patrón neural y la diferenciaciónneuronal. Aunque se ha progresado mucho en este sentido, quedan aún muchaspreguntas sin respuestas para tratar de elucidar el rol que los retinoides juegandurante el desarrollo embrionario. En este trabajo, dentro del contexto de la cascada de la neurogénesis primaria de Xenopus laevis, exploramos la habilidad de los retinoides de regular diferentespasos de la cascada que lleva a la diferenciación neuronal. Mostramos que eltratamiento con ácido retinoico (RA) produjo un sustancial aumento en el númerode neuronas primarias que expresan N-tubulina debido a un incremento de ladiferenciación neuronal sin involucrar cambios en la proliferación o muerte celularprogramada. Las evidencias indican que este efecto se origina en los pasos inicialesde la cascada neurogénica, ya que este tratamiento alteró el balance entre dos genesde prepattern de expresión temprana. Por un lado, se observó inducción de laexpresión de Gli3, que promueve el destino neuronal y por otro, inhibición de Zic2,un represor de la neurogénesis. Además, se modificó la expresión de otrosmarcadores que participan en los pasos intermedios de la cascada como Neurogenina, MyT1 y X-Delta-1. Paralelamente, determinamos que los retinoidesreprimen la expresión de sonic hedgehog (shh) en la línea media del embrión tantoen la placa del piso como en la notocorda y establecímos por primera vez un nexoentre shh, el RA y la neurogénesis primaria. En experimentos de rescate fenotípico demostramos que el RA no es capaz derevertir el efecto inhibitorio de shh, Zic2 o una versión costitutivamente activa de Notch (NotchICD) sobre la neurogénesis primaria. Estos resultados, junto con elhecho de que un pulso corto de RA alrededor del comienzo de la gastrulación essuficiente para desencadenar la inhibición de la expresión de shh, sugieren que el RA participa muy tempranamente en la regulación de esta vía. El tratamiento con agonistas y antagonistas selectivos de los receptores de ácidoretinoico (RAR) nos permitió, por un lado, confirmar que la activación de los RARes suficiente para inhibir la expresión de shh e inducir la neurogénesis y por otro,determinar que RARα es necesario in vivo tanto para regular la expresión de shh,como para establecer el patrón normal de neuronas primarias. Mediante una estrategia de dominancia negativa establecimos que el receptor RARα1 es requerido para la correcta regulación de shh, ya que cuando se interfierecon su función, la expresión de shh se desinhibe. Finalmente, el bloqueo específico de la síntesis de RARγ1 por microinyección deun oligo morfolino antisentido produjo un aumento muy marcado de la expresiónde shh, sugiriendo que esta isoforma también es necesaria para mediar laregulación negativa que los retinoides ejercen sobre la expresión de shh. Contrariamente, mostramos mediante esta misma estrategia, que el receptor RARα2.2 no es necesario para ejercer in vivo esta regulación. Todos estos resultados en conjunto proveen nuevas evidencias que profundizan lacomprensión del rol de los retinoides durante el desarrollo embrionario, enparticular durante la neurogénesis primaria y aportan herramientas críticas paraayudar a descifrar los mecanismos moleculares que determinan la construcción enespacio y tiempo de la placa neural.
The first step in making the nervous system of a vertebrate is the segregation of theneural plate. Several reports suggest that retinoid signal is essential for normalneural patterning and neuronal differentiation. Although there was a lot of progressin this way, many questions remain without answers to elucidate the role thatretinoids play during development. In this work, inside the context of Xenopus laevis primary neurogenesis cascade,we explored retinoid's ability to regulate different steps of the cascade that lead toneuronal differentiation. We show that retinoic acid (RA) treatment produced asubstantial induction in the number of primary neurons that express N-tubulin dueto a promotion of neuronal differentiation without involving changes inproliferation or programmed cell death. Evidences indicate that this effectoriginates in the initial steps of neurogenic cascade, as this treatment altered thebalance between two prepattern genes with early expression. By one side, weobserved an induction in Gli3 expression, a promotor of neuronal fate and by theother side, inhibition of Zic2, a repressor of neurogenesis. Furthermore, theexpression of other markers that participate in the intermediate steps of the cascade,as neurogenin, MyT1 and Delta-1, was also modified. At the same time, wedetermined that retinoids repressed sonic hedgehog (shh) expression in the embryomidline, both in the floor plate as well as in the notochord and we established forthe first time a link between shh, RA and primary neurogenesis. In phenotypic rescue experiments, we show that RA is not capable to reverse theinhibitory effect caused on primary neurogenesis by shh, Zic2 or a constitutivelyactive form of Notch (Notch ICD). These results, together with the fact that a short RA pulse near the beginning of gastrulation is sufficient to inhibit shh expression,suggest that RA participate very early in the regulation of these processes. The treatment with selective agonists and antagonist of RA receptors (RAR)allowed us, first, to confirm that RAR activation is sufficient to inhibit shhexpression and to induce neurogenesis, and second, to determine that RARα isrequired for proper shh regulation, as when we interfered with its function, shhinhibition was lost. Finally, the specific blockade of RARγ1 synthesis, by microinjection of amorpholino antisense oligo, produced a great induction of shh expressionsuggesting that this isoform is also necessary to mediate the negative regulationthat retinoids exert over shh expression. On the contrary, we showed by the samestrategy, that RARα2.2is not required for this regulation in vivo. All these results together, provide new evidences to understand the role thatretinoids play during development, particularly during primary neurogenesis andcontribute with critical tools to decipher the molecular mechanisms that lead toneural plate construction in space and time.
Fil: Franco, Paula Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.