Papel de los ácidos nucleicos citoplasmáticos de los baculovirus en la producción de IFN-I en células no inmunes de mamífero - Amalfi, Sabrina (2019)
El baculovirus AcMNPV es un virus envuelto, con genoma DNA de doble cadena, patógeno de insectos. Posee un complejo ciclo de replicación bifásico en el que participan dos fenotipos: los virus brotados (BV) y los virus derivados de los cuerpos de oclusión (ODV), los cuales son estructural y funcionalmente distintos. Los BV son capaces de transducir genes bajo la regulación de un promotor adecuado en células de mamífero, aunque no pueden replicar su genoma en este hospedador. Dentro de las aplicaciones de los baculovirus como herramienta biotecnológica en mamíferos, se destacan su uso para el desarrollo de vacunas, para el delivery de genes y como inmunomoduladores. Se ha descripto una potente respuesta inmune innata inducida por BV en mamíferos, capaz de montar un estado antiviral inespecífico por vías independientes de TLR. Así, este trabajo de Tesis tiene como finalidad estudiar la participación de los ácidos nucleicos baculovirales citosólicos en la producción de un estado antiviral en células no inmunes de mamífero. En primer lugar, mediante ensayos de transcripción con baculovirus recombinantes se demostró que el citoplasma es el principal destino que alcanza el genoma baculoviral en distintos tipos celulares no inmunes. A continuación, se observó que los BV -pero no los ODV- son capaces de producir un estado antiviral y un aumento de IFN β en fibroblastos murinos. Además, se determinó que baculovirus pseudotipados con la proteína G (VSV) ingresan a la célula de manera más eficiente pero no producen mayores niveles de IFN β. Finalmente, se estudió la participación de distintos sensores citosólicos de DNA en células murinas y en células humanas infectadas con BV y se observó que la enzima RNA Pol III no está relacionada en el establecimiento del estado antiviral. La vía cGAS-STING en células murinas fue estudiada mediante edición génica por CRISPR-Cas9, mientras que en células epiteliales humanas se estudió mediante transcomplementación de cGAS o cGAS y STING en las células HEK293 y HEK293 T, respectivamente. Los resultados mostraron que STING es una proteína necesaria para el establecimiento de un estado antiviral en células de mamífero. Además, al menos dos vías de señalización distintas impactan en STING y contribuyen al estado antiviral por baculovirus. La detección del genoma viral por el sensor cGAS induce la respuesta celular más potente y es necesaria para la producción de IFN β. Además, la activación de STING, de un modo cGAS independiente, da lugar a un estado antiviral en el cual, en células epiteliales humanas, participa la producción de IFN λ1. En conclusión, los resultados de esta Tesis muestran que el genoma del baculovirus AcMNPV disponible en alta proporciones en el citosol en el contexto de infección de células no inmunes de mamífero, desempeña un papel relevante en el establecimiento de un estado antiviral y en la producción de IFN I y III a través del impacto en la vía de reconocimiento de ácidos nucleicos cGAS-STING.