Caracterización de las proteínas codificadas por el Cotton leafroll dwarf virus y de un clon infectivo del virus - Delfosse, Verónica Cecilia (2017)
El algodón (Gossypium spp.) es un cultivo regional económicamente clave en el noreste argentino, cubriendo en la actualidad 500.000 hectáreas. La enfermedad azul es la principal enfermedad viral del algodón y causa importantes pérdidas en el cultivo si no se implementan medidas adecuadas de control consistentes en la siembra de cultivares resistentes a la enfermedad y en el control de los insectos vectores mediante insecticidas. La enfermedad es producida por el cotton leafroll dwarf virus (CLRDV), una especie dentro del género Polerovirus de la familia Luteoviridae. Los síntomas característicos de la enfermedad son enanismo, enrollamiento de las hojas, textura coriácea con coloración verde oscura‐azulada y clorosis en las nervaduras. El virus es transmitido en forma circulativa y no propagativa por el pulgón del algodón Aphid gossypii, no siendo posible su transmisión mecánica. El CLRDV posee un genoma de RNA de simple cadena (ssRNA) positiva de 5,866 kb. El genoma de los virus pertenecientes al género Polerovirus está formado por siete marcos abiertos de lectura (ORFs). Los ORFs 0, 1 y 2 se traducen a partir del RNA viral dando como producto las proteínas P0, P1 y la proteína P1‐P2 a partir de un cambio de marco traduccional. La proteína P0 corresponde en algunos virus del género al supresor del silenciamiento génico, las proteínas P1 y P1‐P2 serían componentes de la RNA polimerasa dependiente de RNA. Los ORFs 3, 3a, 4 y 5, se traducen a partir de un RNA subgenómico, dando lugar a las proteínas P3, P3a, P4 y P3‐P5. La proteína P3 corresponde a la cápside viral, P3a y P4 corresponderían a las proteínas de movimiento viral y P3‐P5 al dominio readthrough de la proteína de cápside que estaría implicada en la transmisión del virus por el insecto vector. En los programas de mejoramiento del cultivo de algodón, la selección de variedades de algodón con resistencia genética a la enfermedad azul se realiza mediante la infección de las plantas con insectos vectores que son criados en el laboratorio y que poseen el virus. En el presente trabajo se construyó y caracterizó un clon infectivo de cDNA del CLRDV. Este sistema permitió desarrollar una estrategia alternativa de infección mediante la inoculación del virus vía agroinfección, independizándose de la transmisión por el insecto vector, y por otro lado es esencial para el desarrollo de un sistema de genética reversa que permita el estudio de la expresión y función de los genes virales, de la replicación del virus y la interacción plata‐virus a nivel molecular. Se caracterizó el clon infectivo del virus mediante ensayos de agroinfección en plantas de G. hirsutum NC33B (variedad susceptible a la infección por CLRDV). Se registró la aparición de síntomas típicos de la enfermedad en las plantas bajo estudio y se confirmó la infección a distintos tiempos postinfiltración en las hojas sistémicas mediante las técnicas de RTPCR, Northern y Western blot. A su vez, se demostró la transmisibilidad del virus desde plantas agroinfiltadas hacia plantas sanas mediada por áfidos, corroborando así que las partículas virales producidas por la agroinfección son infectivas y transmisibles por el vector natural. Además, se agroinfiltraron plantas de G. hirsutum variedad Guazuncho 2 (resistentes a la infección por CLRDV) y se comprobó que el virus no logra infectar esta variedad. Realizando el mismo tipo de ensayos, se comprobó que el clon infectivo del CLRDV tiene la capacidad de infectar las plantas modelo Arabidopsis thaliana y Nicotiana benthamiana. Si bien en ambas especies los ensayos moleculares demostraron la infección y la movilidad del virus sistémicamente, solo se observaron síntomas (clorosis internerval) en N. benthamiana. El estudio y la caracterización del clon infectivo de CLRDV permitieron desarrollar una técnica más sencilla de infección, que actualmente se está utilizando como sistema de infección de rutina en el programa de mejoramiento de algodón del INTA para la selección de germoplasma resistente a CLRDV. Para la caracterización de las proteínas CLRDV, se estudiaron las interacciones entre proteínas virales mediante el sistema de doble híbrido en levaduras. Se detectó interacción entre la proteína de cápside viral (P3) entre sí y con la proteína minoritaria de capside P3P5 y además se observó interacción de la proteína de movimiento (P4) entre sí. El silenciamiento génico constituye un mecanismo de defensa antiviral en plantas desencadenado por el RNA doble cadena. Como mecanismo de contra defensa, la mayoría de los virus vegetales poseen proteínas con función supresora del silenciamiento. Con el fin de avanzar en la comprensión de las bases moleculares de la enfermedad se investigó si el CLRDV posee una proteína capaz de suprimir el silenciamiento génico. Para ello se utilizaron dos sistemas basados en el silenciamiento de la proteína GFP, que permiten describir el mecanismo de acción y la etapa en la vía del silenciamiento que estaría afectada por el supresor. Estos estudios permitieron determinar que la proteína P0 del CLRDV es un supresor de silenciamiento local, que actúa bloqueando la vía del silenciamiento río arriba del proceso de amplificación. A su vez, no es capaz de inhibir la síntesis de RNAs pequeños (siRNAs) a partir de RNA de doble cadena ni es capaz de bloquear la movilidad sistémica de la señal de silenciamiento. Utilizando los mismos sistemas de silenciamiento se probó la actividad supresora del silenciamiento del clon infectivo de cDNA del CLRDV y se observó que la proteína P0 expresada en el contexto viral conserva la misma actividad supresora. Mediante un software de predicción se identificaron las proteínas P3 y P4 del CLRDV como otros potenciales supresores del silenciamiento génico postranscripcional, y se analizó su actividad de la misma forma que fue evaluada la proteína P0, pero estas proteínas no presentaron actividad supresora del silenciamiento en ninguno de los sistemas utilizados. Además, se evaluó comparativamente la virulencia de la proteína P0 del CLRDV y la proteína P0 del Cotton leafroll dwarf virus‐at (CLRDV‐at). Este virus es una variante nueva del CLRDV que quiebra la resistencia del germoplasma local estableciendo una infección suave con síntomas diferentes a enfermedad azul. Para ello se estudió la virulencia de P0 en el contexto de la infección de un virus heterólogo. Se analizó la exacerbación de los síntomas de PVX en presencia de las proteínas P0 en plantas de N. benthamiana. Se observó que la construcción PVX‐P0^CLRDV desarrollaba síntomas severos con respecto al PVX salvaje y el PVX^P0CLRDV-at desarrollaba síntomas suaves, mostrando que P0^CLRDV presenta mayor virulencia que P0^CLRDV-at. Según se describe en bibliografía la proteína P0 de algunos polerovirus interactúan con la proteína ASK1 del sistema SCF ubiquitina ligasa. Al interaccionar con dicho complejo median la degradación de la proteína ARGONAUTA 1 (AGO1) de la vía de silenciamiento génico de la planta. Utilizando la técnica de doble hibrido en levaduras se determinó que la proteína P0 del CLRDV también interacciona con el sistema SCF ubiquitina ligasa. Para ello se evaluó la interacción de las proteínas ASK de A. thaliana y sus correspondientes ortólogos: SKP1 de N. benthamiana y GSK1 de Gossypium hirsutum. Se determinó que la proteína P0 es capaz de interaccionar con SKP1 y GSK1, pero no fue posible determinar su interacción con ASK mediante la técnica utilizada. Estudios previos indican que la interacción entre la proteína P0 y ASK ocurre a través del dominio F‐box (LPXXL/IX_10-13P) de la proteína P0. Con el objetivo de determinar si la interacción con el sistema SCF ubiquitina ligasa de la proteína P0 del CLRDV es dependiente de la conservación del dominio F‐Box se realizaron mutantes en la región consenso del dominio. A partir del dominio F‐box de P0^CLRDV (LPFIIX_10P) se desarrollaron las mutantes P0^mut1 (LPFIvX_10P), P0^mut2 (aaFIIX_10a) y P0^mut3 (aaFIIX_10P). Teniendo en cuenta la secuencia del P0^CLRDV-at (LPFLvX_10P) se desarrolló el mutante P0^mut1 sobre la secuencia del P0^CLRDV y el mutante P0^mut4 (LPFLiX_10P) sobre la secuencia del P0^CLRDV-at. Se analizó la actividad supresora de los mutantes en el dominio mediante ensayos basados en el silenciamiento de la proteína GFP, en los cuales los mutantes P0^mut2 y P0^mut3 perdieron completamente la actividad supresora mientras que los mutantes P0^mut1 y P0^mut4 conservaron su actividad supresora con una leve variación en las intensidades de supresión. Mientras P0mut1 disminuyó su actividad respecto de P0^CLRDV, P0^mut4 la aumentó respecto de P0^CLRDV‐at. Consistente con los resultados in planta las mutantes P0^mut2 y P0^mut3 perdieron la interacción con las proteínas SKP1 y GSK1 en el sistema de doble híbrido en levaduras, mientras que P0^mut1 y P0^mut4 conservaron la capacidad de interaccionar con ellas. Estos resultados indican que la conservación del consenso LP de dicho dominio es indispensable para que ocurra la interacción y para que la proteína P0 posea su actividad supresora. Por último, mediante ensayos de coagroinfiltración de las proteínas P0 y AGO1, se logró determinar que en presencia de la proteína P0 la proteína AGO1 es degradada. De esta manera se confirmó que el mecanismo de acción de la proteína P0^CLRDV es conservado respecto de otras proteínas P0 caracterizadas previamente. A su vez, aquellos mutantes que perdieron su capacidad supresora tampoco fueron capaces de inducir la degradación de AGO1 señalando que el dominio F‐box está implicado en el mecanismo de patogenicidad de la proteína P0. Finalmente, se analizó la localización subcelular de la proteína P0 mediante la expresión de P0 fusionada a GFP. Mediante microscopía confocal se determinó que la proteína P0 se localiza en citoplasma y núcleo de células del mesófilo foliar de N. benthamiana. El clon infectivo del CLRDV constituye una herramienta que permitirá avanzar en el estudio de la expresión y función de los genes virales y de la replicación viral por genética reversa. Se trata del primer clon infectivo capaz de infectar plantas de algodón y permite acelerar los procesos de búsqueda de genes de resistencia en bancos de germoplasma de algodón. Además, facilitará el trabajo en plantas modelo utilizadas para el estudio de la interacción planta‐patógeno tales como N. benthamiana, así como el uso de las colecciones de mutantes de A. thaliana para profundizar en el estudio de las funciones virales y su interacción con el hospedador. Estos resultados representan un importante avance en el conocimiento de la función de las proteínas codificada por el CLRDV, especialmente en la comprensión de la función e interacciones de P0 con proteínas de sus hospedantes. En conclusión, proporcionan un punto de partida para la comprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la enfermedad azul producida por la infección del CLRDV.