Regulación de la expresión de ACSL4 por mecanismos post-traduccionales y su rol en el metabolismo mitocondrial

• Autores: Benzo, Yanina
• Año de publicación: 2021
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Maloberti, Paula Mariana; Poderoso, Cecilia
• Materia: ACSL4; ACIDO ARAQUIDONICO; CANCER DE MAMA; MECANISMOS POST-TRADUCCIONALES-UBIQUITINACION; METABOLISMO MITOCONDRIAL; BIOENERGETICA; ACSL4; ARACHIDONIC ACID; BREAST CANCER; POST-TRANSLATIONAL MECHANISMS-UBIQUITINATION; MITOCHONDRIAL METABOLISM; BIOENERGETICS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

En la actualidad es sabido que los lípidos son biomoléculas que están involucradas en vías de transducción de señales, y que los desequilibrios en su metabolismo causan múltiples trastornos de alta prevalencia. Dentro de los lípidos más estudiados en la actualidad, se encuentra el ácido araquidónico (AA), debido a las funciones que cumple tanto esta molécula como sus metabolitos, los eicosanoides, en el control de la homeostasis celular. Previamente, en nuestro laboratorio se ha descripto el rol de la enzima Acil- CoA sintetasa 4 (ACSL4) en la regulación de los niveles del AA intracelular en la esteroidogénesis y en células tumorales. ACSL4 participa en la fisiopatología del cáncer de mama, y, la desregulación de los niveles de expresión de esta esta enzima se vincula con la agresividad tumoral. Recientemente, se demostró la existencia de una regulación diferencial en los mecanismos de transcripción de ACSL4, en líneas celulares de cáncer de mama humano de diferente agresividad. Sin embargo, se sabe que existen otros mecanismos regulatorios post-traduccionales, tales como la fosforilación y la ubiquitinación, que podrían estar involucrados en la regulación de la expresión de la ACSL4 y por ende, en la tumorigénesis. Por lo tanto, en esta tesis doctoral, se propone profundizar en el estudio de los mecanismos post-traduccionales que podrían afectar la expresión de ACSL4 en células de cáncer de mama de distinta agresividad. Utilizando líneas celulares de cáncer de mama de distinta agresividad, MCF7 (menos agresiva), y MDA-MB-231(más agresiva) se observó que la estabilidad de la proteína es menor en la línea menos agresiva. A través de ensayos con MG-132, reconocido inhibidor proteasomal, determinamos también que el proteasoma está involucrado en la degradación de ACSL4 y por lo tanto, en los niveles de expresión y estabilidad de la enzima. Mediante la búsqueda en bases de datos y ensayos de mutagénesis sitio dirigida, pudimos identificar a las lisinas 621 y 702 de ACSL4 como posibles blancos de ubiquitinación. Además, identificamos a la enzima E3- ligasa Parkina como una de las candidatas a realizar esta modificación post-traduccional y, demostramos que efectivamente, existe una interacción entre ACSL4 y Parkina. Por otro lado, a través de estudios in sílico, observamos que ACSL4 regula la expresión de genes relacionados con el metabolismo y la función mitocondrial, en células de cáncer de mama. Actualmente, se sabe que las mitocondrias juegan un papel clave en la oncogénesis, es por eso que, en este trabajo, decidimos profundizar sobre el rol de ACSL4 en el metabolismo mitocondrial en células tumorales mamarias de distinto nivel de agresividad. Utilizamos células MCF-7 que sobreexpresan ACSL4 de manera estable (MCF-7 tet-off/ACSL4) y células MDA-MB-231 silenciadas para la expresión de ACSL4 (shACSL4). Evaluamos si ACSL4 regula la expresión de distintos marcadores mitocondriales. Realizamos ensayos con el objetivo de medir la masa, la actividad y la bioenergética mitocondrial que nos permitieron determinar cómo la expresión y/o ausencia de ACSL4 afecta estos parámetros. Logramos determinar que ACSL4 regula positivamente la expresión de marcadores mitocondriales tales como NRF1, VDAC1 y el Complejo III de la cadena respiratoria. Además, en los estudios de bioenergética medimos la tasa de consumo de oxígeno, y en base a los resultados obtenidos, analizamos distintos parámetros respiratorios. Demostramos que la expresión de ACSL4 en células de cáncer de mama produce cambios significativos en la tasa de respiración máxima, la capacidad de reserva respiratoria y la fuga de protones. Estos resultados indican que las células que sobreexpresan ACSL4 poseen una mejor capacidad de respuesta frente a situaciones de demanda energética. Además, en células MCF-7 tet-off/ACSL4 observamos mayor actividad mitocondrial y una disminución en la masa mitocondrial con respecto al control, lo cual sugiere una compensación del genoma mitocondrial ante la disminución en su cantidad. Por otro lado, los resultados obtenidos con la línea MDA-MB- 231 shACSL4 son opuestos a lo observado en células MCF-7 tet-off/ACSL4, lo cual valida el rol de ACSL4 en células de cáncer de mama sobre diversos parámetros mitocondriales. Los resultados del siguiente trabajo contribuyen a ampliar los conocimientos sobre la regulación de ACSL4 y el rol que ejerce en el metabolismo mitocondrial, permitiendo profundizar en el conocimiento de la fisiopatología de la célula tumoral y los mecanismos moleculares involucrados.
Currently, it is known that lipids are biomolecules that are involved in signal transduction pathways, and that imbalances in their metabolism cause multiple highly prevalent disorders. Arachidonic acid (AA) is among the most studied lipids today, due to the functions that this molecule and its metabolites, the eicosanoids, fulfill in the control of cellular homeostasis. Previously, our laboratory has described the role of the Acyl-CoA synthetase 4 (ACSL4) enzyme in the regulation of intracellular AA levels both in steroidogenesis and tumor cells. ACSL4 participates in breast cancer pathophysiology, and the dysregulation in the levels of expression of this enzyme are linked to tumor aggressiveness. Recently, the existence of a differential regulation in ACSL4 transcription mechanisms was demonstrated in human breast cancer cell lines of different aggressiveness. However, it is known that there are other post-translational regulatory mechanisms, such as phosphorylation and ubiquitination, that could be involved in the regulation of ACSL4 expression and, therefore, in tumorigenesis. Therefore, in this doctoral thesis, it is proposed to delve into the study of post-translational mechanisms that could affect the expression of ACSL4 in breast cancer cells of different aggressiveness. Using breast cancer cell lines of different aggressiveness, MCF7 (less aggressive), and MDA-MB-231 (more aggressive) it was observed that protein stability is lower in the less aggressive line. Using MG-132, a recognized proteasomal inhibitor, we also determined that the proteasome is involved in the degradation of ACSL4 and therefore, in the levels of expression and stability of the enzyme. By searching databases and site-directed mutagenesis assays, we were able to identify ACSL4 lysines 621 and 702 as potential ubiquitination targets. Furthermore, we identified the enzyme E3-ligase Parkin as one of the candidates to carry out this post-translational modification and, we demonstrated that, indeed, there is an interaction between ACSL4 and Parkin. On the other hand, through in silica studies, we observed that ACSL4 regulates the expression of genes related to metabolism and mitochondrial function in breast cancer cells. Currently, it is known that mitochondria play a key role in oncogenesis, that is why, in this work, we decided to delve into the role of ACSL4 in mitochondrial metabolism in breast tumor cells of different levels of aggressiveness. We used MCF-7 cells that stably overexpress ACSL4 (MCF-7 tet-off / ACSL4) and MDA-MB-231 cells silenced for the expression of ACSL4 (shACSL4). We evaluate whether ACSL4 regulates the expression of different mitochondrial markers. We carried out tests with the objective of measuring mitochondrial mass, activity and bioenergetics that allowed us to determine how the expression and / or absence of ACSL4 affects these parameters. We were able to determine that ACSL4 positively regulates the expression of mitochondrial markers such as NRF1, VDAC1 and Complex III of the respiratory chain. Furthermore, in the bioenergetics studies we measure the rate of oxygen consumption, and based on the results obtained, we analyze different respiratory parameters. We show that ACSL4 expression in breast cancer cells produces significant changes in the maximum respiration rate, respiratory reserve capacity, and proton leak. These results indicate that cells that overexpress ACSL4 have a better response capacity in situations of energy demand. In addition, we observed in MCF-7 tet-off / ACSL4 cells a greater mitochondrial activity and a decrease in mitochondrial mass respect to the control, which suggests a compensation of the mitochondrial genome in the face of the decrease in its quantity. On the other hand, the results obtained with the MDA-MB-231 shACSL4 cell line are opposite to what was observed in MCF-7 tet-off / ACSL4 cells, validating the role of ACSL4 in breast cancer cells on various mitochondrial parameters. The results of the following work expand the knowledge about the regulation of ACSL4 and the role that this enzyme plays in mitochondrial metabolism, allowing to deepen the knowledge of the pathophysiology of the tumor cell and the molecular mechanisms involved.
Fil: Benzo, Yanina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.