Obtención y caracterización de antígenos protectores de Trypanosoma Cruzi contra la enfermedad de Chagas - Búa, Jacqueline Elena (1991)
La fracción flagelar de epimastigotes de la cepa Tulahuén de Trypanosomacruzi es una subfracción celular heterogénea, conteniendo flagelos y membranasdel parásito. En modelos experimentales murinos, la inmunización con fracción flagelarliofilizada y Bordetella pertussis como adyuvante, protege de la infección por T.cruzi en términos de mortalidad y de esterilidad parasitémica ya que un 60% de losratones desafiados no presentan parasitemia detectable. En este trabajo se presenta la caracterización de componentes antigénicosdel estadio epimastigote obtenidos por purificación a partir de un anticuerpomonoclonal anti-fracción flagelar. Dicho anticuerpo monoclonal, FCH-F8-4 (AcMo 4), mostró una interesante actividad biológica contra el Trypanosoma cruzi, ya queevidenció la capacidad de lisar tripomastigotes sanguíneos por medio delcomplemento y de neutralización in vitro de la infectividad de tripomastigotes. El AcMo 4 reconoce seis proteínas por "inmunoblotting" en epimastigotes ydos proteínas en tripomastigotes. A partir del homogenato total de epimastigotes se purificaron loscomponentes antigónicos reconocidos por el AcMo 4. Las proteínas aisladascorrespondieron al patrón previamente observado para el extracto de epimastigotesoriginal. Cuando se ensayó la capacidad inmunoprotectiva in vivo de estosantígenos purificados, con Bordetella pertussis como adyuvante, se observó queestas proteínas del T. cruzi mantienen las propiedades inmunoprotectoras de lafracción flagelar en cuanto a sobrevida de los animales desafiados y el bajoporcentaje de ratones que presentan parasitemia. Utilizando el AcMo 4 se seleccionaron clones en una biblioteca de ADNcopia de epimastigotes de T. cruzi, construída en el vector de expresión λgt 11. Conuno de los clones de ADN recombinante obtenidos λ(FCH-FB-4)1, con un inserto de 150 pares de bases, se ensayó su hibridización al ARNm de epimastigotes. Los estudios realizados mediante la hibridización del clon λ(FCH-F8-4)1con el ADN del parásito sugirió que esta información genética estaría repetida enel genoma haploide de T. cruzi en un número bajo de copias. El análisis de este clon respecto de su hibridización con diferentes clones ycepas del parásito reveló que este gen se halla ampliamente presente en T. cruzi,siendo el patrón de esta hibridización conservado para los aislados y clonesestudiados. A partir de la secuencia de bases del ADN del clon λ(FCH-F8-4)1 ydeducida la secuencia de aminoácidos, se sintetizó en fase sólida un péptido de 19aa:SP4(PAFLGCSSRFSGSFSGVEP). Este péptido inhibió la reactividad de sueros deratones inmunizados con fracción flagelar, en ensagos de ELISA, utilizandoepimastigotes como antígeno. Los ratones inmunizados con el péptido SP4 libre o acoplado a KLH comoproteína transportadora, adyuvado siempre con Bordetella pertussis, mostraronuna respuesta inmune humoral y celular contra el T. cruzi, demostrada poranticuerpos y reacciones cutáneas de hipersensibilidad retardada específicos. Estos resultados indicaron que la conformación del epitope presente en el péptidosintético representa aquella que se encuentra en el parásito y que a pesar de supequeño tamaño, el péptido fue capaz de evocar una respuesta inmune, aún inoculadoen su forma libre. Un estudio por computacion a partir de la secuencia primaria deaminoácidos, siguiendo un algoritmo previamente descripto, arrojó que el péptido SP4 tiene una estructura anfipática de alfa-hélice que podría representar sitios dereconocimiento para los linfocitos T colaboradores. Otros clones de ADN recombinante, obtenidos de la misma genoteca de ADNcopia de la cepa Tulahuén, fueron obtenidos con el AcMo 4 g con sueros de conejoanti-péptido sintético SP4. Dichos clones fueron analizados en cuanto a lasecuencia de bases de su ADN, observándose diferencias en algunas bases yaminoácidos que codifican. Se describen aquí dos secuencias de ADN con homologíaparcial reconocidas por el AcNo 4 y un suero policlonal anti-péptido sintético;pudiendo estas secuencias representar dos copias diferentes dentro del gen quecodifica para este antígeno. Los analisis efectuados por hibridización de los diferentes clones de ADNrecombinante con el ADN genómico del parásito, sugiere que habría un único genque codifica para la síntesis de los péptidos que reconoce el AcMo 4 en el genomadel Trypanosoma cruzi.