Estudio de dinámica de biomoléculas en sistemas complejos mediante la combinación de técnicas avanzadas de microscopía y simulación computacional

• Autores: Angiolini, Juan Francisco
• Año de publicación: 2017
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Levi, Valeria; Mocskos, Esteban Eduardo
• Materia: MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA; ESPECTROSCOPIA DE CORRELACION DE FLUORESCENCIA; SIMULACIONES COMPUTACIONALES; DIFUSION; FACTORES DE TRANSCRIPCION; DESARROLLO EMBRIONARIO; MATERIALES MESOPOROSOS; FLUORESCENCE MICROSCOPY; FLUORESCENCE CORRELATION SPECTROSCOPY; COMPUTATIONAL SIMULATION; DIFFUSION; TRANSCRIPTION FACTORS; EMBRYONIC DEVELOPMENT; MESOPOROUS MATERIALS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

En las últimas décadas, la espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) seconvirtió en un grupo de técnicas ampliamente usadas para estudiar la dinámica demoléculas en sistemas de diversa complejidad. Estas técnicas son mínimamenteinvasivas y permiten determinar con alta resolución espacio-temporal coeficientes dedifusión, constantes cinéticas e interacciones moleculares tanto in vivo como in vitro. Eneste trabajo de tesis, desarrollamos una combinación de métodos de FCS y simulacionescomputacionales para comprender procesos difusivos en sistemas complejos. Lasherramientas y conocimientos obtenidos fueron aplicados al estudio de la dinámica defactores de transcripción en embriones tempranos de ratón y al estudio de la difusiónen sistemas porosos ordenados. Una pregunta muy importante en el campo de desarrollo embrionario es en quémomento del desarrollo las células que componen el embrión de mamíferos comienzana ser diferentes entre sí y cómo estas diferencias influencian el destino de las célulashijas. Para responder esta pregunta, utilizamos FCS y caracterizamos la dinámica deciertos factores de transcripción (i.e. Sox2, Oct4 y Cdx2) en el núcleo de las células deembriones tempranos de ratón. Además, para interpretar los resultados obtenidosdesarrollamos FERNET (Fluorescence Emission Recipes and NumErical routines Toolkit),una herramienta que permite simular experimentos de FCS en escenarios máscomplejos y realistas. Nuestro análisis permitió determinar que los datos de FCS pueden ser interpretados porun modelo que considera que los factores de transcripción difunden en el núcleo celulare interactúan con dos poblaciones de sitios en la cromatina, con distintos tiempos deinteracción. Estos estudios permitieron determinar que cuando el embrión estáformado por tan sólo por cuatro células ya existen diferencias en la interacción de Sox2con el ADN, las cuales se correlacionarían con el linaje final de la progenie celular. En una segunda etapa, exploramos la difusión de sondas fluorescentes en films deóxidos mesoporosos, materiales sumamente relevantes por sus posibles aplicacionescomo sensores, catalizadores, y para la adsorción de gases. A diferencia del escenarioanterior, en este caso el sistema es altamente restringido y la geometría es estática. Nuestros estudios permitieron caracterizar la influencia de ciertas propiedades del film (i.e. tamaño de poros y cuellos) en la difusión de una sonda fluorescente. Con el fin decomprender las tendencias observadas en los experimentos realizamos simulacionesestocásticas en sistemas periódicos con potenciales simples.
In the last decades, fluorescence correlation spectroscopy (FCS) became a widely usedgroup of techniques for the study of molecular dynamics in systems with diversecomplexity. These techniques are noninvasive and allows the determination of in vivoand in vitro diffusion coefficients, kinetic constants and molecular interactions with highspatiotemporal resolution. In the present thesis work we developed and employed acombination of FCS methods and computational simulations to study the underlyingprocesses in the motility of molecules in complex systems. The tools and knowledgeobtained was applied to the study of transcription factor dynamics in early mouseembryos and diffusion in ordered porous systems. One of the most important questions in this field is when the cells of an embryo beginsto behave differently and how these differences influences its cell fate. To answer thisquestion, we employed FCS to study the interaction between certain transcriptionfactors involved in embryonic development with chromatin in early mouse embryos. Moreover, we developed FERNET (Fluorescence Emission Recipes and NumEricalroutines Toolkit) to aid in the results interpretation, a toolkit to simulate FCSexperiments in more complex and realistic scenarios. Our analysis allowed us to determine that the experimental data could be explained bya model that considers two distinctly binding sites populations, each with itscorresponding residence time. By performing single cell FCS experiments we determinedthat when the embryo is at its 4-cell stage Sox2 interacts differently with DNA. Moreover, those cells with more Sox2-DNA interaction shows a greater predispositionto form the embryo inner mass. Secondly, we explored the diffusion of fluorescent dyes in mesoporous oxide films. Dueto the relevance of these materials as sensors, catalysts, gas sorption, among other uses,we studied the diffusion of molecules inside the films. We observed how properties of the material, such as pore size, pore connectivity and coating restrict and influences themass transport inside these materials. In contrast with the previous scenario, thismaterial represents a highly restricted and static system, with dimensions clearlydefined and partially known. To replicate and explain the observed tendencies in theexperimental data we performed stochastic simulations in periodic systems with simpleand easy to implement potentials.
Fil: Angiolini, Juan Francisco. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.