Expresión de antígenos de Trypanosoma cruzi en Escherichia coli y Staphylococcus aureus y su rápida purificación - Moreno, Juan Ignacio (1992)
Siendo la enfermedad de Chagas es uno de los problemasendemicos mas importantes en Latinoamerica, el clonado deantígenos del agente causal, Trypanasoma cruzi, ya sea parael diagnostico o el desarrollo de una vacuna, fue uno de losobjetivos mas importantes. Uno de los problemas que a menudo se presentan es laforma de obtener proteínas por tecnicas de ADN recombinante,en niveles que puedan ser llevados a escala industrial. Eneste caso particular, se ha estudiado la forma de expresareficientemente y purificar cuatro antígenos clonados los queposeen un alto indice de reacción frente a sueros depacientes con enfermedad de Chagas (Ibañez y col 1987). La expresión y purificación de estas proteinas estuvobasada en un sistema de fusión con la Proteina A de Staphylococcus aureus. Los vectores de expresion usados eneste trabajo de tesis fueron los de la serie pRIT. (Nilsson ycol, 1990) y sus hospedadores fueron Escherichia coli (E.coli) y Staphylococcus aureus (S.aureus) (Löwenadler y col 1986), siendo este último muy poco estudiado en la expresiónde proteinas recombinantes (Nilsson y col, 1990). Una vez que las fusiones fueron expresadas, estaspudieron ser recuperadas y purificadas por cromatografía deafinidad IgG-Sepharosa en un solo paso. El esquema basico de expresión y purificación consistióen lo siguiente: 1) Expresión de la proteina fusión por la bacteria hospedadoraya sea S.aureus como E.coli. 2) Recuperación de la fusión en extractos celulares o en elmedio de cultivo libre de celulas por cromatografía deafinidad IgG-Sepharosa. 3) Proteólisis enzimática especifica en el sitio de unión dela proteina A con el antigeno. 4) Eliminación de la proteina A liberada y de la fusiónremanente por un segundo pasaje por la columna de cromatografiade afinidad, recuperandose el antigeno auténtico en elefluente. Los resultados en esta primera etapa permitieron extraerlas siguientes conclusiones: 1) Las fusiones son principalmente encontradas dentro de lacelula en E.coli, mientras que en S.aureus son excretadas almedio de cultivo. 2) Las proteinas de fusión son facilmente rescatadas ypurificadas por cromatografía de afinidad. 3) Los niveles de expresión fueron de una magnitud tal quepueden ser llevados a escala industrial tanto en E.coli comoen S.aureus. 4) S.aureus probó ser el hospedador de elección porque ladegradación proteica fue menor y se evitó el proceso deruptura celular. Esta ultima ventaja hace que seanprocesables grandes volúmenes de cultivo en forma mucho masrápida y menos costosa. 5) Salvo en un solo caso, la proteólisis especifica separo enforma eficiente, ambas mitades de las fusiones. 6) La ulterior purificación del antígeno auténtico postclivadopor un segundo pasaje por la columna de cromatografíade afinidad, mostro una recuperacion de aproximadamente el 80%. En un primer paso, la producción de estos antígenos, poreste sistema, para ser usados como reactivo de diagnostico,mostró que puede llevárselo a escala industrial, por losniveles de expresión la facilidad de su manejo y su rapidez. Las hidrofobicidad pareció influir en la degradación dealgunas fusiones durante la expresión en este sistema, cuyaforma de actuar fue discutida. La metodología empleada para cada antígeno en particularlos que en principio serian cuatro, podria ser simplificadaaún mas. Esto fue logrado a través de construcciones en laque dos o mas genes fueron fusionados para producir una únicaproteína que conservaría la misma capacidad de reaccionar conantisueros de pacientes como lo hacen cada uno de ellos porseparado. La idea fue aproximarse a la obtención de unapoliproteína única que represente a todos los antígenos adisposición de forma tal de expresar, recuperar y purificartodo el "repertorio" en un solo procedimiento. Los resultados obtenidos hasta aqui mostraron que ademásde ser posible la fusión de tres antíqenos distintos, lainmunoreactividad mostraron que cada antígeno en la moléculaúnica, reaccionó con sus correspondientes antisuerosespecificos sin interferencia por los demas, demostrando, enprimera instancia, que este tipo de quimera puede ser llevadaa una prueba de campo. Además queda abierta la posibilidad deque quimeras como las que se construyeron en este trabajo,puedan contribuir a experimentos de protección.