Rol de alfa-sinucleína en la función y dinámica mitocondrial en modelos experimentales de la Enfermedad de Parkinson

• Autores: Martínez, Jimena Hebe
• Año de publicación: 2016
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Kotler, Mónica Lidia
• Materia: ALFA-SINUCLEINA; ENFERMEDAD DE PARKINSON; MITOCONDRIA; DINAMICA MITOCONDRIAL; AUTOFAGIA; ALFA-SYNUCLEIN; PARKINSON DISEASE; MITOCHONDRIA; MITOCHONDRIAL DYNAMICS; AUTOPHAGY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La enfermedad de Parkinson es una patología neurodegenerativa que afecta al 1% de la población mayor de 60 años. Se caracteriza por déficits motores, temblor en reposo y una pérdida selectiva de las neuronas dopaminérgicas de la Substantia Nigra Pars Compacta. Otro rasgo típico es la aparición de agregados proteicos conocidos como cuerpos de Lewy cuyo principal componente es una pequeña proteína, α-sinucleína. Esta proteína se une a las membranas lipídicas y en su conformación de α-hélice podría modular la fusión de las vesículas sinápticas con las membranas pre-sinápticas e influiría en la liberación de neurotransmisores. En condiciones patológicas, α-sinucleína sería capaz de unirse a las mitocondrias y se ha propuesto que esta unión provocaría disfunción mitocondrial y estrés oxidativo que colaborarían en el desarrollo de la enfermedad. La hipótesis de este trabajo propone que AS se incorpora a la mitocondria y se distribuye en sus distintos compartimientos. En esas localizaciones, esta proteína generaría disfunción mitocondrial incidiendo negativamente sobre distintos parámetros metabólicos, sobre la dinámica mitocondrial y la autofagia. En el presente trabajo se estudió la localización específica de α-sinucleína en mitocondrias aisladas de cerebro de rata. Se emplearon técnicas de microscopía de fluorescencia, microscopía electrónica de transmisión, Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET), fraccionamientos celulares y mitocondriales, western blots y distintos ensayos bioquímicos. Los resultados obtenidos en mitocondrias aisladas mostraron que AS 1μM se asocia a la mitocondria, mayoritariamente en la membrana externa y AS 10μM y 50 μM se encuentra principalmente internalizada. La microscopía electrónica confirmó la localización de α-sinucleína en el interior de la mitocondria y también en la periferia. Mediante un experimento de FRET se demostró un posible rol para el transportador de membrana externa TOM en la incorporación de AS. El análisis de la funcionalidad mitocondrial reveló que α-sinucleína altera el consumo de O2, elpotencial de membrana, la producción de ATP y aumenta la generación de especies reactivas de oxígeno. Por otra parte, se utilizaron células SH-SY5Y transfectadas con α-sinucleína para estudiar el efecto sobre la viabilidad celular, la producción de ATP, la generación de especies reactivas de oxígeno, la dinámica mitocondrial y la autofagia. Los resultados revelaron una disminución significativa de la viabilidad, en paralelo a una disminución en la producción de ATP y generación aumentada de especies reactivas. Además, α-sinucleína indujo disipación del potencial de membrana mitocondrial, desbalance de los procesos de fisión-fusión y desencadenamiento de la autofagia y mitofagia. Estos últimos procesos actuarían como un mecanismo de rescate celular disminuyendo la muerte y eliminando la mitocondrias dañadas. Este trabajo agrega evidencia novedosa al conocimiento de la localización de α-sinucleína en los distintos compartimientos mitocondriales, sus efectos sobre la funcionalidad mitocondrial y la relevancia de la disfunción de la organela en el destino celular. De este modo representan una contribución a la comprensión de los procesos que llevan a la patogénesis de la Enfermedad de Parkinson.
Parkinson disease is a neurodegenerative pathology of the central nervous system affecting 1% of the population over 60 years old. This disease is characterized by motor deficiency, rest tremor, and the selective loss of dopaminergic neurons of the Substantia Nigra Pars Compacta. Another typical feature is the occurrence of protein aggregates known as Lewy’s bodies. The main component of Lewy’s bodies is a small protein named α-synuclein. This protein binds to lipidic membranes. The α-helix conformation could regulate the fusion between synaptic vesicles and pre-synaptic membranes modulating the neurotransmitter release. In pathological conditions, α-synuclein is associated to mitochondria. This interaction would trigger mitochondrial impairment and reactive oxygen species generation both events involved in the development of Parkinson's disease. This study hypothesizes that α-synuclein could be incorporated into the mitochondria and distribute in their different compartments. In these locations, this protein would be able to impair the mitochondrial function implying processes such as metabolic imbalance, mitochondrial dynamics and autophagy. The present work studies the specific location of α-synuclein in isolated rat brain- mitochondria. Techniques of fluorescence microscopy, transmission electron microscopy, Förster Resonance Energy Transfer (FRET), cellular and mitochondrial fractionation, western blots and several biochemical assays were used. Results showed that α-synuclein 1μM was associated to mitochondria mainly on the outer membrane while α-synuclein 10μM and 50μM were internalized. Electron microscopy supported α-synuclein location inside the mitochondrion and also in the periphery. A possible role for the transporter outer membrane (TOM) in the incorporation of α-synuclein to mitochondria was suggested by FRET assay. The analysis of mitochondrial functionality revealed that α-synuclein alters O2consumption, mitochondrial membrane potential and ATP production. In addition, an increase in the reactive oxygen species generation was observed. On the other hand, employing a cellular experimental model (SH-SY5Y cells transfected with α-synuclein) we demonstrated that this protein diminished cell viability and reduced ATP production with a concomitant increase in reactive oxygen species generation. In addition, α-synuclein was able to trigger mitochondrial membrane dissipation, imbalance in fission-fusion processes, autophagy and mitophagy. Both autophagy and mitophagy could act as rescue cellular mechanisms by decreasing cell death and damaged mitochondria. Taken together, these results add new evidence to the knowledge of mitochondrial specific α-synuclein location, the effects of this protein on the mitochondrial functionality and the relevance of this organelle dysfunction on cell viability. Thereby, these studies represent a contribution to understand the processes leading to development of Parkinson Disease.
Fil: Martínez, Jimena Hebe. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.