La reacción del Carbazol en la valoración de los ácidos hexurónicos - Peluffo, Horacio (1955)
a) Parte teórica: Se definen los Acidos Hexurónicos como productosde oxidación del grupo primario de las hexosas y no establece su nomenclaturay la de sus derivados. Se citan las fuentes naturales yse hace una breve reseña histórica de los mismos. En particular se tratan los ácidos glucurónicosgalacturónico y manurónico respecto de la estructura de las formas D y L y de las antípodas alfa y beta; se citan sus propiedades físicasy químicas y los procedimientos de obtención. Sobre los glucurónidos se detallan propiedades yse mencionan las teorías enunciados sobre el origen de los mismosen el organismo, el sitio de la conjugación y el mecanismo de la misma. Respecto del metabolismo del ácido glucurónico seacepta el esquema de Fishman y sus colaboradores, se comenta la influencia de la dieta en la excreción y se citan los usos terapeuticos dedicho ácido. Los métodos de valoración de los Acidos Hexurónicosse agrupan en cinco clases: I)los basados en la producción defurfural; II)idem en la producción de CO2; III)idem en las propiedadescromógenas; IV)idem en las propiedades reductoras; V)idem en laactividad óptica (polarimetria). Se discuten cada uno de esos métodos y en especial el que utiliza elnaftoresorcinol como reactivo. Sobre éste se mencionan sus propiedadeslos medios de obtención y las distintas técnicas en que se emplea. b) Parte experimental: Se detalla la técnica de Dische para el ácidoglucurónico. Se dan indicaciones sobre los reactivos y en especialsobre el carbazol. Trabajando con glucurona se estudió la reaccióndel carbazol y se ratifican los resultados obtenidos por Dische. Se estudia el desarrollo del color en el tiempo,se selecciona el filtro en el Pulfrich (S53)y se establece la curvade absorción con el espectrofotómetro de Beckman. Se fijaron lascondiciones experimentales (tiempo de calentamiento, influencia de latemperatura, adición y concentración de los reactivos, idem de la temperaturade reacción). Se determinó el Eo de la reacción en el fotómetrode Pulfrich y sobre los ensayos de proporcionalidad se realizóun estudio estadístico que se completa con el trazado de la recta deextinción vs concentración por el método de los cuadrados mínimos. Se realizó un estudio similar y paralelo sobrela reacción del carbazol con la glucosa y con dos glucurónidos (bornil y mentil) que se obtuvieron en el laboratorio por vía biológica. Se introdujeron variantes en la técnica y seestudió la influencia de las mismas llegando a establecer la necesidadde trabajar a temperatura constante. Se establece definitivamente la siguientetécnica: A 1 ml de solución de ensayo (conteniendo de 5 a 60 microgramospor ml) se le agregan 6 ml de H2SO4 concentrado Merck, se calienteal baño maria (100°c) durante 20 minutos y se enfría luego a 20°C, se agregan 0,2 ml de solución alcohólica de carbazol al 0,10%y se deja reaccionar a 20°C durante dos horas. Se lee en el Pulfrichla extinción contra un blanco análogo pero con agua destilada en vezde la solución de ensayo. Filtro S53 (530 milimicrones); cubas de l cm EO = 7,503. Al estudiar la aplicación de dicha técnica a lavaloración de hexurónidos en el suero humano se estudió previamentela influencia de los desproteinizantes (tungstico,(OH)2Zn,(OH)2Cd,acido metafosfórico, alcohol.acetona y ácido tricloroacético). Se prefiereel ácido tricloroacético y con su empleo se realizan ensayosde recuperación de glucurona sobre soluciones de ovoalbúmina y desuero sanguíneo. Se discuten los resultados obtenidos comparándoloscon los publicados anteriormente y se citan valores normales. Se estudió la aplicación de la reacción del carbazola la valoración de los hexurónidos en la orina, trantando de eliminarpreviamente las interferencias que producen color de carbonización. Se intentó la eliminación de urea, el tratamiento con adsorbentes (Norita, tierra Fuller, ceolin, silicato de aluminio Lloyd), consolventes (cloroformo, eter, alcohol amílico), la defecación por precipitación de (OH)2Cu, (OH)2Zn, por acetato de plomo neutro y básico. Ningunode estos procedimientos es eficaz por lo que se optó por realizarla valoración con orina diluida 1/20 y un blanco para la lecturafotométrica que lleva todos los reactivos, incluso orina, pero no llevacarbazol. Los ensayos de recuperación de glucurónidos y deglucurona con orina resultaron satisfactorios y sobre muestras de orinade 2h horas, en 24 sujetos normales adultos, se determinó la tasade excreción normal de ácido glucurónico total.