Mediciones con resolución nanométrica mediante depleción por emisión estimulada - Bordenave, Martín Diego (2016)
Desde los estudios de Ernst Abbe, a finales del siglo XIX, se dio por aceptado que la microscopía óptica de campo lejano tenía un límite en su poder de resolución espacial: objetos que se encontraran más cercanos entre sí que media longitud de onda de la luz utilizada no podrían distinguirse. Sin embargo, en las últimas dos décadas se han desarrollado un número de técnicas basadas en fluorescencia que mantienen las ventajas de la microscopía óptica decampo lejano, y proporcionan una resolución espacial limitada únicamente por el tamaño del marcador fluorescente. Estas técnicas se denominan microscopías de superresolución o nanoscopías de fluorescencia e involucran la transición entre estados moleculares de los fluoróforos que permitan o no la emisión de fluorescencia. En particular, en la nanoscopía STED (Stimulated Emission Depletion), se produce esta transición mediante depleción por emisión estimulada, con el fin de desactivar fluoróforos en regiones controladas del espacio y de esta forma reducir el volumen efectivo de observación. En el marco de esta tesis, y gracias a una colaboración formal y activa con Stefan W. Hell (Department of Nano Biophotonics, Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen, Germany), galardonado en 2014 con el premio Nobel de Química por su trabajo pionero en las nanoscopías de fluorescencia, se construyó el primer nanoscopio STED de Argentina (Grupo de Nanofísica Aplicada, Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Buenos Aires (BA), Argentina). El nanoscopio STED se aplicó para indagar y dilucidar problemas biofísicos con resolución nanométrica. En colaboraciones interdisciplinarias se estudió: (a) la organización de proteínas en la membrana del Trypanosoma cruzi, en colaboración con el Grupo de Inmunología Molecular, Instituto de Investigaciones Biotecnológicas (IIB), Universidad Nacional de San Martín (UNSAM), CONICET, BA, Argentina; (b) procesos de reestructuración del citoesqueleto de los conos de crecimiento durante la polarización neuronal, en colaboración con el Laboratorio de Neurobiología, Instituto de Investigación Médica de Córdoba (INIMEC), CONICET, Córdoba, Argentina; y (c) la formación y estabilidad de estructuras periódicas de actina en procesos de degeneración axonal, en colaboración con el Laboratorio de Neurobiología, INIMEC, CONICET, Córdoba, Argentina y el Grupo de Neurobiología Molecular, Instituto de Investigación en Biomedicina de Buenos Aires (IBIOBA), CONICET, BA, Argentina. Asimismo, se desarrolló un nuevo esquema de implementación de la nanoscopía STED que expande considerablemente su campo de aplicación. Generalmente, luz de longitud de onda situada en la zona roja lejana del espectro de emisión del fluoróforo es utilizada para inducir el fenómeno de emisión estimulada. En esta tesis, se demuestra que STED continuo (CW) también es posible utilizando longitudes de onda de STED ubicadas en el máximo deemisión, donde la sección eficaz de emisión estimulada puede ser hasta 10 veces mayor. Como resultado, es posible obtener imágenes de STED utilizando potencias proporcionalmente menores. Además, fluoróforos que se consideraban inadecuados para ciertas configuraciones espectrales de nanoscopía STED, pueden ser utilizables.