Abstract:

En la presente tesis de doctorado se llevó a cabo el estudio de soluciones sólidas nanoestructuradas de ceria dopada con gadolinia, GdxCe1-xO2-x/2 (GDC), con el objetivo principal de correlacionar las propiedades morfológicas, estructurales, óxido-reductoras y catalíticas de este tipo de compuestos. El control de estas propiedades es fundamental para su aplicación en dispositivos tecnológicos, ya sea como catalizadores para diferentes reacciones o como materiales para la generación de energía, mediante su empleo como ánodo en celdas de combustible de óxido sólido (SOFC). La síntesis de soluciones sólidas GDC se realizó mediante el empleo de diferentes métodos, especialmente aquellos que permiten un amplio control sobre la morfología de los productos finales. En particular, para la obtención de polvos nanoestructurados se utilizaron los métodos de complejación de cationes y microemulsión inversa. En el caso de nanoestructuras con morfología tubular se empleó el método de llenado de moldes poliméricos, mientras que para la obtención de esferas nanoestructuradas se usó el método de síntesis hidrotérmica asistida por microondas. Las soluciones sólidas de GDC fueron caracterizadas mediante difracción de rayos X (XRD), análisis de área superficial específica (isoterma de adsorción BET) y microscopía electrónica de barrido y transmisión (SEM y TEM). El estudio de las propiedades estructurales y físicoquímicas se realizó mediante en el empleo de técnicas de radiación sincrotrón, tales como XRD y espectroscopia de absorción de rayos X (XANES), tanto en atmósferas oxidantes como reductoras a diferentes temperaturas. En todos los casos se comprobó la formación de soluciones sólidas de Gd-Ce-O, las cuales estaban compuestas por cristalitas de tamaño nanométrico, exhibiendo la fase cúbica (estructura tipo fluorita). En particular, se reportó por primera vez la obtención de GDC nanostructurada con morfología tubular, la cual exhibió los más altos valores de área específica (100 m2.g-1) respecto de las otras morfologías. Se estudió la adición de pequeñas cantidades de Pd por distintas vías de síntesis en muestras de GDC. Las muestras obtenidas se caracterizaron con las técnicas citadas y se determinó que el Pd puede encontrarse tanto distribuido homogéneamente en la red cristalina como en forma de una fase segregada, PdO, según el método de síntesis. Mediante estudios realizados por XANES en el borde Ce-L3 en atmósferas reductoras, se mostró que la incorporación de Pd afecta notoriamente el comportamiento de la cupla Ce3+/Ce4+ de las soluciones sólidas de GDC. Finalmente, estudios de la actividad catalítica frente a la combustión de CH4 usando como catalizadores GDC puro o dopado con Pd mostraron que la adición de bajas cantidades de Pd conduce a una mayor combustión de CH4 a más bajas temperaturas. Los estudios aquí realizados mostraron que los óxidos mixtos nanoestructurados de GDC presentan propiedades que los convierten en muy buenos candidatos para ser empleados como ánodos en dispositivos SOFC.

In the present doctoral thesis work, nanostructured solid solutions of gadolinia doped ceria, GdxCe1-xO2-x/2 (GDC), were studied with the aim of correlating their morphological, structural, catalytic and redox properties. It is fundamental to control these properties, since they are strictly related to the uses of these compounds and their applications in technological devices, i.e. several applied catalytic reactions, as well as clean energy generation in the form of anodes for solid oxide fuel cells (SOFCs). GDC synthesis was carried out via different methods, especially those that allow good control over the final product morphology. Specifically, nanostructured powders were obtained by the cation complexation and reverse microemulsion methods. For tubular nanostructured morphologies, the polymeric template-filling method was employed; while nanostructured spheres were obtained by microwave assisted hydrothermal synthesis. GDC characterisation were carried out using X-ray diffraction (XRD), specific surface analysis (BET adsorption isotherm), and scanning and transmission electronic microscopy (SEM and TEM). Physico-chemical characterisation involved synchrotron radiation techniques, particularly XRD and X-ray absorption spectroscopy (XANES), taking measurements under controlled reducing or oxidizing atmospheres, as well as at controlled applied temperatures. Gd-Ce-O solid solutions were observed in all above cases, which exhibited fluorite type cubic crystalline structure, made up of nanometric size crystallites. Particularly, nanostructured GDC materials with tubular morphology, which exhibited the highest specific surface areas (100 m2.g-1) compared with the other morphologies, was reported for the first time. Small Pd additions TO GDC samples were MADE using several synthesis methods. The samples so obtained were characterized with the procedures already mentioned, and it was found that the Pd can be found not only homogeneously distributed in the crystal lattice but also as a segregated secondary PdO phase, depending on the synthesis method. Ce L3–edge XANES measurements carried out under reducing atmosphere showed that Pd noticeably affects the Ce3+/Ce4+ couple behaviour in the GDC solid solutions. Finally, catalytic studies on CH4 combustion were performed, using pure or Pd-doped GDC as catalysts. Those studies showed that small Pd additions lead to an improved CH4 combustion, that is, at lower temperatures for the total CH4 conversion than for conventional materials. The studies here performed showed that GDC nanostructured mixed oxides exhibit properties that make them suitable as candidates for anodes in SOFC devices.

Author affiliation: Muñoz, Fernando Francisco. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

En la presente tesis se ha estudiado cómo afecta el campo eléctrico a las reacciones rédox y de coordinación de ligandos en hemoproteínas de membrana y en porfirinas aisladas. Las porfirinas fueron utilizadas como sistemas modelo del sitio activo de estas proteínas. En principio, a través de cálculos de estructura electrónica, se determinó cómo incluye el campo eléctrico en la energía de reacciones rédox y de coordinación de ligandos en sistemas modelos de sitios activos de hemoproteínas típicas. Con el fin de realizar un estudio experimental, se escogió una reacción en la cual se predijo computacionalmente que el efecto del campo eléctrico sería importante. Por medio de la técnica SERRS (Surface Enhanced Resonance Raman Scattering ), se midió para este sistema la constante de equilibrio de coordinación de un ligando soluble a una porfirina inmovilizada en superficie a distintos potenciales eléctricos aplicados. Posteriormente, utilizando dos estrategias distintas, se estimó la magnitud del campo eléctrico presente a cada potencial de estos experimentos. Finalmente, se estudió utilizando dinámica molecular clásica, el efecto del campo eléctrico en la reacción de disociación de un ligando en la hemoproteína completa citocromo c. Se encontró que no existe efecto del campo eléctrico sobre el sitio activo pero si sobre el resto de la proteína. Se pudo comprender como actúa un campo eléctrico modulando una reacción química tanto en sistemas pequeños y rígidos como las porfirinas, y en sistemas grandes y flexibles como las proteínas. Se identificaron cuáles son las características que debe poseer tal proceso para que sea afectado por el campo eléctrico

The goal of this thesis was to investigate how an electric field affects redox and ligands coordination reactions in membrane hemeproteins and in porphyrins as model systems of the active site of these proteins. In the first place, by means of quantum calculations, it was determined the influence of the electric field over redox and ligands coordination reactions energies in model systems of typical hemeprotein active sites. It was selected a reaction affected by the electric field to prove experimentally the predicted effects. Using the SERRS (Surface Enhanced Resonance Raman Scattering) tecnique, it was measured, for this chosed system, equilibrium constants of ligands coordination to surfaces immobilized porphyrins while applying different electric potentials. Then, using two different strategies, it was determined the electric field magnitudes present in the previous experiments. Finally, it was studied by means of classical molecular dynamics the electric field effects in a ligand disociation reaction in cytochrom c where it was found that there was no electric field effect at the active site but there were significant effects on the protein conformation and dynamics. It was concluded how an electric field modulates a chemical reaction in small and rigid systems as porphyrins, and in big and flexible systems as proteins. It was found which are the characteristics that a process should have to be affected by the field.

Author affiliation: De Biase, Pablo Martín. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Los electrodos modificados químicamente son sustratos conductores recubiertos con una película delgada que les confiriere propiedades funcionales de interés: electrocatálisis, electrocromismo, protección de la corrosión y otras. El método de autoensamblado capa por capa es una técnica para preparar películas de polielectrolitos de espesor nanométrico sobre todo tipo de sustratos. En esta Tesis se estudian las propiedades fisicoquímicas y la respuesta electroquímica de electrodos modificados mediante este método y su dependencia de las condiciones de deposición y medición y de la arquitectura molecular de la película. Los polielectrolitos redox empleados en esta Tesis son una poli(alilamina) modificada con el complejo Os(bpy)2pyCl2+/+ (PAH-Os) y nuevos polímeros conteniendo el complejo [Os(CN)5py]3-/2- . Se estudió la estructura, composición y propiedades electroquímicas de equilibrio de multicapas de polielectrolitos redox empleando una combinación de técnicas espectroscópicas y electroquímicas y modelado teórico. A parir del modelo de Donnan se relacionó el potencial de interface medido por voltametria cíclica con la composición interna y las propiedades de intercambio iónico. Se propuso un conjunto de reglas de diseño para controlar las permselectividad iónica de películas multicapa redox y no-redox controlando la relación entre el pH de ensamblado y de medición y la capa terminal. El caso de una única capa de PAH-Os sobre un electrodo tiolado se estudió con una teoría molecular que considera en forma explícita el tamaño, forma, carga y conformaciones de las todas las moléculas en la interfase, sus interacciones y la presencia de los equilibrios químicos. La teoría describe cuantitativamente la respuesta electroquímica del sistema bajo distintas condiciones experimentales y el espesor de la capa y puede usarse para estudiar propiedades no accesibles a los experimentos. La teoría predice que la estructura, el potencial electrostático y el potencial redox aparente de la cupla redox dependen de la distancia al electrodo y que los equilibrios redox y ácido-base se encuentran acoplados debido a la regulación de carga. Las propiedades de transporte y transferencia de carga en las multicapas se estudiaron con distintas técnicas electroquímicas. Para películas terminadas en polianión, se observa un impedimento al proceso redox. Mediante un análisis con voltametria cíclica y un modelo de difusión modificado, se mostró que el coeficiente de difusión para el transporte de carga cae aproximadamente 3 órdenes de magnitud al adsorber el polianión y que es posible revertir este fenómeno aumentando la fuerza iónica de la solución. Se atribuyó el efecto a cambios en los movimientos segmentales del polímero. Se empleó la técnica de microbalanza de cristal de cuarzo con control electroquímico para estudiar el transporte de iones y solvente en las películas redox. Se observó un aumento de la masa de la película durante la oxidación y una disminución durante la reducción. Este proceso es afectado por la última capa ensamblada y efectos específicos de aniones. Se discute el origen del aumento en la masa de la película que se observa con el número de ciclos de oxidaciónreducción. Se prepararon electrodos modificados con nanopartículas de Pd para reducción electrocatalítica mediante la reducción electroquímica de iones Pd confinados en el interior de una multicapa depositada sobre un electrodo de tela de carbono. El análisis de los materiales preparados mediante XPS, elipsometría y microscopía SEM demostró que las nanopartículas se forman preferencialmente en la interfase electrodo/película. La selectividad y eficiencia de los nanocatalizadores superan con creces la de los electrodos depositados por electroreducción directa de sales de Pd, tradicionalmente usados en la literatura de electrosíntesis. Las películas electroactivas nanoestructuradas preparadas por el método capa por capa presentan algunos comportamientos que no se observan en películas desordenadas depositadas por métodos tradicionales. Estas diferencias surgen de las nuevas variables de proceso disponibles, que pueden ser ajustadas para optimizar las propiedades funcionales.

Chemically modified electrodes are conductive substrates coated with a thin layer that introduces functional properties of interest: electrocatalysis, electrochromism, corrosion protection and so on. Layer by layer self-assembly is a novel method for the preparation of nanometer-thick polyelectrolyte films. In this thesis we address the physicochemical properties and electrochemical response of layer by layer modified electrodes and their dependence on the assembly, testing conditions and the molecular architecture of the film. The redox polyelectrolytes used in this Thesis are a poly(allylamine) modified with the complex Os(bpy)2pyCl2+/+ (PAH-Os) and new polymers bearing the complex [Os(CN)5py]3-/2- . The structure, composition and equilibrium electrochemical properties of redox polyelectrolyte multilayers were studied with a combination of spectroscopic and electrochemical techniques and theoretical models. The Donnan partition model was used to link the interfacial potential measured by cyclic voltammetry with the inner composition and ionic exchange. We proposed a set of design rules to control ionic permselectivity in redox and non-redox multilayers by means of the relationship between assembly and testing pH and the polyelectrolyte in the outmost layer. In order to study a single layer of PAH-Os on a thiolated electrode we developed a molecular theory which explicitly considers the size, shape, charge and conformations of all the molecular species at the interface, their interactions and the chemical equlibria. It quantitatively describes the electrochemical response under different experimental conditions as well as the thickness of the layer. Moreover, the theory can be used to study properties that are difficult to address experimentally. It predicts that the structure, electrostatic potential and apparent redox potential of the couple depend on the distance to the electrode. The theory shows the coupling between the redox and acid-base equilibria that arises due to charge regulation, as well as its experimental manifestations. Charge transfer and transport in multilayer films were studied with different electrochemical techniques. For polyanion capped multilayers, we observe a hindrance for the redox process. Based on cyclic voltammetry measurements and a modified diffusion model, we showed that the diffusion coefficient for charge transport decreases by 3 orders of magnitude upon the assembly of the polyanion and that this hindrance for the redox process can be eliminated by increasing solution ionic strength. The effect was attributed to changes in polymer segmental mobility. In order to study ion and solvent fluxes in the films we used electrochemical quartz crystal microbalance. An increase of film mass during oxidation and a decrease upon reduction was observed. This process is affected by the outmost layer and specific anionic effects. We discuss why the mass of the film increases with the number of oxidation-reduction cycles. We prepared electrodes modified with Pd nanoparticles for electrocatalytical hydrogenation. This material was prepared by electroreduction of Pd ions confined inside a multilayer deposited on a carbon felt electrode. The as prepared electrodes were characterized with XPS, ellipsometry and SEM. These techniques showed that the nanoparticles preferentially grow at the electrode/film interface. The selectivity and performance of the nanocatalyzers greatly surpasses those of the electrodes prepared by direct electroreduction of Pd salts in solutions, which are a standard in the electrosynthesis literature. Electroactive nanostructured multilayer fims can behave differently to random films prepared by traditional techniques. The differences arise from the new process variables available in the layer by layer technique, which can be tuned to optimize film functional properties.

Author affiliation: Tagliazucchi, Mario Eugenio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Se estudió comparativamente el comportamiento electroquímico de flavinas en solución acuosa, en hidrogeles redox de poli-alilamina altamente hidratados, y como anión dopante de polipirrol. Se utilizaron técnicas electroquímicas y espectroscópicas uv-visible de absorción y emision simultánea a la oxidación-reducción de las flavinas. En solución acuosa se encontró que la disproporcionación de la semiquinona de la flavina conduce a una complicación cinética respecto de un mecanismo simple de transferencia de dos electrones y dos protones. En los electrodos modificados se observó que los hidrogeles de poli-alilamina brindan un ambiente altamente hidratado y la electroquímica y la espectroscopía son similares a las soluciones acuosas. Sin embargo, la protonación de aminos primarios fijos en la caden polimérica afecta la energía libre del proceso redox a través de un potencial de membrana. Los electrodos modificados por polipirrol con flavina atrapada son los que se presentan como más complejos. La matriz rígida del polímero, que en este caso puede oxidarse y reducirse en la misma ventana de potencial que la flavina lleva a un comportamiento electroquímico y espectrocópico bien diferenciado. Se encuentran cambios espectrocópicos de la flavina y del polipirrol al cambiar el estado de oxidación. Además, las especies redox de ambos sistemas pueden interactuar por reacciones químicas acopladas.

The electrochemical behaviour of flavins has been studied comparatively in aqueous solutions, in highly hydrated redox hydrogels of poly-(allylamine), and as a dopant anion of polypyrrole. In aqueous solutions, it was found that the disproportionation of flavin simiquinone leads to a kinetic complication with respect to a simple two electron two proton electron transfer mechanism. In modified electrodes it was found that poly-(allylamine) hydrogels yield a highly hydrated environment and the electrochemistry and spectroscopy are similar than in aqueosus solutions. However, protonation of primary amine groups fixed to the polymer backbone affects the redox process free energy through a membrane potential. Modified electrodes with polypyrrole and trapped flavin are the more complex ones. The rigid polymer matrix, which in this case can be oxidised and reduced in the same potential window that flavin gives a distinct electrochemical and spectrocopic behaviour. Spectroscopic changes due to flavin and polypyrrole are observed when the oxidation state changes. Besides, both systems' redox species can interact through coupled chemical reactions.

Author affiliation: Bonazzola, Cecilia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Pseudomonas extremaustralis es un organismo Antártico, que presenta alta resistencia al estrés y produce polihidroxibutirato (PHB). En este trabajo, se estudió su metabolismo microaeróbico, que está regulado en Pseudomonas por Anr. Se observó que es capaz de utilizar nitrato, reduciéndolo solo a nitrito. El genoma posee todos los genes involucrados en la desnitrificación, con excepción de los genes nir. Los genes de la fermentación de L-arginina son funcionales en esta especie. Anr afectó positivamente la síntesis de PHB. Asimismo, influenció el estado redox celular, el consumo de oxígeno, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la producción de exopolisacáridos (EPS) y proteínas extracelulares, la biosíntesis de aminoácidos y la utilización de distintas fuentes de carbono. Los biofilms presentan gradientes de O2. El PHB contribuyó a la supervivencia en forma planctónica en biofilms en frío y su ausencia resultó en una mayor formación de biofilms y EPS y menor movilidad. Anr también afectó el desarrollo de biofilms, dado que mutantes anr mostraron defectos en su formación, así como menor adhesión, agregación y mayor movilidad. En el genoma de esta especie se detectaron 167 probables blancos de regulación (Regulon Anr). Los resultados en conjunto muestran la importancia de Anr sobre la fisiología de P.extremaustralis.

Pseudomonas extremaustralis is an Antarctic organism that shows high stress resistance and polyhydroxybutyrate (PHB) production. We studied the microaerobic metabolism, which is controlled by Anr in Pseudomonas species. This strain was capable to reduce nitrate, used as an electron acceptor, to nitrite. P.extremaustralis genome presented the genes involved in denitrification, excepting the nir genes. The genes involved in L-arginine fermentation were also functional in this species. Anr positively affected PHB synthesis. In addition, this regulator influenced the cellular redox state, oxygen consumption, the presence of oxygen reactive species, the exopolysaccharides (EPS) and extracellular proteins production, the aminoacid biosynthesis and carbon source utilization. Biofilms show oxygen gradients. PHB contributed to the survival of planktonic cells in the biofilm at cold conditions and its absence resulted in higher biofilm formation and EPS production and also lower motility. Additionally, Anr affected biofilm development; since an anr mutant strain showed defects in biofilm formation and cellular adhesion and aggregation and motility alterations. We detected 167 putative regulated target genes at the P.extremaustralis genome. These results show the important role of Anr in the P.extremaustralis physiology.

Author affiliation: Tribelli, Paula María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

En este trabajo de tesis se presenta la funcionalización de diferentes superficies con materiales compuestos formados por polielectrolitos y surfactantes para el desarrollo de sensores. Como sistema modelo se utilizó poli(alilamina) y dodecilsulfato de sodio. El sistema ha demostrado ser mecánicamente robusto y factible de ser modificado según la función que se le desee conferir. El polielectrolito se ha derivatizado primero con un complejo redox, a fin de explorar su uso como mediador en sensores amperométricos, y posteriormente con lactosa, de manera de incorporar sitios de unión a lectinas. Por otra parte, el surfactante se ha utilizado para la dispersión de nanotubos de carbono cuyas propiedades electrocatalíticas se ejemplifican en la determinación de dopamina. A lo largo de esta tesis se estudió la inmovilización del material compuesto empleando distintas metodologías, tales como adsorción capa por capa, aplicación a partir de una suspensión o a partir de una solución en solvente orgánico, evidenciando la versatilidad de manipulación del sistema. Los resultados alcanzados utilizando el complejo polielectrolito-surfactante y los compuestos derivados de su funcionalización muestran la posibilidad de generar robustos materiales autoensamblados con interesantes propiedades respecto a los procesos de transferencia electrónica, ya sea debido a la presencia de mediadores redox o catalizadores. Otra de las interesantes características del complejo polielectrolito-surfactante es su capacidad de ser aplicado sobre una amplia variedad de superficies empleadas en la construcción de sensores, tales como grafito, oro y silicio. En esta tesis se presentan una descripción detallada del alcance de esta metodología, mostrando su gran versatilidad, lo que allana el camino hacia la construcción de una nueva clase de dispositivos moleculares.

This thesis introduces the functionalization of different surfaces with composite materials consisting of polyelectrolytes and surfactants for sensors development. As a model system we used poly(allylamine) and sodium dodecylsulfate. The system has proven to be mechanically robust and feasible to be modified according to the required function. The polyelectrolyte was first derivatized with a redox complex, to explore its use as a mediator in amperometric sensors, and later with lactose, to display lectins-binding sites. Moreover, the surfactant was used to disperse carbon nanotubes, which electrocatalytic properties are exemplified in the detection of dopamine. Throughout this thesis we studied the immobilization of this material using different methodologies, such as layer by layer assembly, application from a suspension or from a solution in organic solvent, expressing the versatility of the system. The results achieved using the polyelectrolyte-surfactant composite material and the compounds derived from its functionalization show the ability to generate robust self- assembled materials with remarkable electron transfer properties, either due to the presence of redox mediators or catalysts. Another interesting characteristic of polyelectrolyte-surfactant complex is its faculty to be applied on a wide variety of surfaces employed to build sensors, such as graphite, gold and silicon. In this thesis, we present a detailed description of the scope of this methodology, expressing its striking versatility, which paves the route towards the construction of new class of molecular electronic devices.

Author affiliation: Cortez, María Lorena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

MODULACIÓN REDOX DE LOS RECEPTORES GABACρ1: En condiciones fisiológicas en el SNC la producción de especies reactivas de oxígeno es una consecuencia natural del metabolismo celular y el posible daño oxidativo se encuentra balanceado por antioxidantes intrínsecos. La actividad de un gran número de receptores sinápticos y canales iónicos puede ser modulada por agentes redox endógenos y/o farmacológicos. Estos incluyen a los NMDAR y AChR, así como también a los GABAAR, entre otros. Aunque, los GABAAR son susceptibles a diversos agentes redox, estudios previos sugerían una falta de sensibilidad de los GABACR a este tipo de modulación. Con el fin de estudiar si compuestos con propiedades redox son capaces de modular la actividad de los GABACR se expresaron heterólogamente en ovocitos de Xenopus laevis GABACR ρ1 homoméricos (GABAρ1R), y sus respuestas -corrientes de Cl- evocadas por GABA- se registraron electrofisiológicamente. Nuestros resultados muestran que los GABAρ1R, al igual que otros miembros de la familia cys-loop, son sensibles a los agentes redox. En presencia de compuestos reductores las curvas D-R se desplazaron hacia la izquierda, mientras que los oxidantes produjeron el efecto opuesto, esto indica un aumento o una disminución, respectivamente, en la afinidad aparente por el agonista de los GABAρ1R. Asimismo, encontramos que la modulación inducida por ácido ascórbico, un antioxidante celular, presenta tanto componentes redox como alostèricos. La modulación de los GABAρ1R fue suceptible a la modificación química de los grupos sulfhidrilos y a la mutación H141D, indicando que estos sitios, localizados en el dominio extracelular, tienen un importante rol en el proceso.

REDOX MODULATION OF GABAC ρ1 RECEPTORS: Free radical production is a natural consequence of metabolism and the possible oxidative damage is limited by cellular antioxidant mechanisms. Activity of many receptors and channels in the CNS can be regulated by redox mechanisms. Whereas the action of redox agents has been demonstrated on GABAA receptors, the sensitivity of GABAC receptors has not been studied. Here we report the effects of ascorbic acid, together with several reducing and oxidizing agents on homomeric GABAρ1 receptors (GABAρ1R) expressed in X. laevis oocytes. Our results showed that, similarly to others members of the cys-loop family, GABAρ1R were highly sensitive to redox modulation. Dose–response curves for GABA were shifted to the left in the presence of reducing agents, whereas oxidizing agents produced the opposite effect. Susceptibility was strongly dependent on GABA concentration. We also found that ascorbic acid modulation had both redox and non-redox components. GABAρ1R modulation was affected by chemical modification of SH- and site-directed mutagenesis of H141, indicating that these sites, located in the extracellular domain, play a key role in this process.

Author affiliation: Calero, Cecilia Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Se diseñaron sistemas de sensores y actuadores de dimensión molecular con el fin de tomar datos analíticos con una alta resolución espacial y temporal, y a la vez poder actuar químicamente sobre el sistema de la misma forma. Para ello se utilizó un enfoque que consiste en el diseño de actuadores en base a la química de los compuestos de coordinación de Ru(II)-bipiridina, los cuales fueron caracterizados, analizando en particular su fotoquímica. La interface entre los sensores y actuadores moleculares y el entorno macroscópico se desarrolló mediante cámaras digitales de alta resolución y de videocámaras digitales de alta velocidad y bajo costo, acopladas a microscopios iluminados por LEDs o láseres de estado sólido. Se ha sintetizado un fotoliberador de una base, la cual permite aumentar el pH de forma localizada, el cual fue utilizado en forma simultánea con un sensor basado en un indicador ácido-base, tanto en un sistema FIA como en otra clase de sistemas. La técnica utilizada para la determinación de la variable pH fue el uso de microscopía de trasmisión, lo que tiene la ventaja de evitar la necesidad de utilizar intensidades de irradiación elevadas como en el caso de técnicas de fluorescencia. También se diseñó y sintetizó un sensor de potencial redox con las bandas de absorción sintonizadas para aplicar en mediciones utilizando el mismo método de detección con cámaras CCD. Por otro lado, se diseñaron distintas sondas fluorescentes en las cuales actúa un proceso de transferencia de energía que fue utilizado para favorecer la fotoliberación de moléculas enjauladas a longitudes de ondas largas. Este fenómeno de transferencia de energía fue aplicado al desarrollo de un compuesto capaz de producir un efecto de las mismas características que la excitación convencional de dos fotones, donde la luz emitida mantiene una dependencia no lineal, sino cuadrática, respecto de la luz de irradiación, evitando la necesidad de las altísimas potencias instantáneas necesarias en la excitación de dos fotones convencional, en la que ambos fotones deben llegar en un tiempo del orden de las transiciones electrónicas. Este tipo de sondas podrían ser la base, de nuevas técnicas de microscopía de fluorescencia, permitiendo reducir enormemente los costos de equipamiento.

The present work involves the development of sensors and actuators with molecular dimensions to obtain analytical data with high spatial and temporal resolution and to chemically actuate on the system in the same way. The approach chosen involves the design of actuators based on the chemistry of Ru(II)-bipyridine coordination compounds which were characterised photochemically. The interface between the molecular probes and the macroscopic environment was based on high-resolution digital cameras and low cost high speed digital video cameras that were coupled to a microscope illuminated by LEDs or solid-state lasers. A caged base that photodeliveries an amine was synthesized. After irradiation the expelled base increases the pH in a localized area. It was used simultaneously an acid-base indicator as probe, in a FIA system model and other types of systems. The pH data was obtained by transmission microscopy. This provides the advantage of avoiding the need to use high irradiation intensities as with fluorescence techniques. It was also designed and synthesized a redox probe with absorption bands that were tuned in order to be compatible with the color filters of digital color cameras. Several fluorescent probes were also designed in which an energy transfer process allows the photodelivery of caged molecules with long wavelength light. This phenomenon of energy transfer was also applied to the development of a compound capable of producing an effect of the same characteristics as conventional two-photon excitation, where the emitted light maintains a nonlinear dependence but quadratic with respect to the irradiation light while avoiding the usual need of very high instantaneous power to get both photons arriving at a time on the electronic transitions. This kind of probes could be the base of new techniques of fluorescence microscopy, allowing a significant reduction on equipment costs.

Author affiliation: Carrone, Guillermo Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Un biosensor constituye un dispositivo de reconocimiento molecular donde una macromolécula, generalmente de origen biológico interactúa con un analito en forma específica e inicia asi un proceso que se transduce en una señal eléctrica. Dentro de esta categoría podemos distinguir a los electrodos enzimáticos amperométricos, donde son medidos cambios de corriente eléctrica sobre un electrodo de trabajo a partir de variaciones en el estado rédox de un mediador que participa del proceso biocatalítico con la enzima rédox. La regeneración del estado rédox inicial del mediador sobre la superficie de un electrodo — aplicando potenciales apropiados — permite que se produzca un estado estacionario en la catálisis y por ende una corriente eléctrica también estacionaria. Este flujo de electrones se halla correlacionado en forma directa con el consumo del analito. El estudio de electrodos enzimáticos amperométricos ha estado tradicionalmente ligado a la inmovilización de las enzimas rédox en matrices poliméricas. Lamentablemente, estos sistemas integrados presentan dificultades para su estudio a escala molecular dadas por la complejidad y falta de control en la organización espacial del biosensor. Esto impide un análisis microscópico de las variables que afectan la respuesta de estos biosensores tales como el espesor, la concentración de enzima y mediador rédox o la cinética de reacción entre la enzima rédox y el mediador. La presente tesis propone una estrategia para el diseño de electrodos enzimáticos amperométricos para su utilización como biosensores. Esto involucra el empleo de técnicas de autoensamblado electrostático con el objetivo de depositar en forma altemada y secuencial la enzima rédox y el mediador. De esta manera es posible evaluar distintos parámetros de la película formada: la cantidad de enzima adsorbida, empleando la microbalanza de cuarzo (QCM); los sitios rédox depositados, por medio de técnicas electroquímicas; el espesor, mediante elipsometría y la morfología de la superficie, utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). Por otra parte, es evidente que el grado de control en el diseño del electrodo enzimático amperométrico permite analizar su respuesta en función de la estructura construida. En este contexto, se trabajó con dos enzimas rédox aniónicas: glucosa oxidasa (GOx) y peroxidasa de soja (SBP), mientras que se empleó polialilamina catiónica modificada con un complejo de [Os(bpy)2ClpyCHO]+(PAH-Os) y un polielectrolito rédox globular de origen dendrítico, poliamidoamina modificada con el mismos complejo (PAMAM-Os) como mediadores rédox. En una primera etapa, se estudió el efecto de la estructura electrostática sobre la respuesta electroquímica de la PAH-Os. Dado que el film depositado es multi-bipolar, posee la propiedad de excluir iones por fuerzas electrostáticas repulsivas. En este sentido, el autoensamblado de PAH-Os con polielectrolitos aniónicos como poliestirensulfonato (PSS) y polivinilsulfonato (PVS) permitió elaborar un modelo de membrana permselectiva para analizar este comportamiento. Las cargas positivas - dadas por los grupos amino - y negativas — dadas por los grupos sulfonato - determinan la aparición de un potencial de membrana que puede ser interpretado en términos del potencial de Donnan. De esta manera, en soluciones de baja fuerza iónica, la permselectividad impuesta por este potencial se torna evidente y el tipo de ion excluido depende de la identidad de la capa terminal y del pH de la solución, afectando el potencial formal de la cupla de PAH-Os en la estructura. Por otra parte, en soluciones de alta fuerza iónica, el potencial formal de la cupla de PAH-Os en la estructura se aproxima al valor del complejo de [Os(bpy)2ClpyCHO]+ en solución. El uso de la microbalanza de cuarzo electroquímica (EQCM) demostró la naturaleza de los iones intercambiados entre la película depositada y solución de electrolito en cada una de las situaciones descriptas anteriormente. Se reconocen tres procesos asociados en el diseño de un biosensor. Por un lado el mediador rédox inmovilizado electrostáticamente sobre el electrodo debe intercambiar electrones con esta superficie. En una segunda etapa, la carga rédox debe propagarse a lo largo de las capas sucesivas. Finalmente, el mediador rédox debe alcanzar el grupo prostético rédox de la enzima para realizar la transferencia electrónica. De esta forma es posible transducir el proceso de reconocimiento molecular del sustrato efectuado por la enzima en una corriente catalítica. En particular, un aumento de la concentración del sustrato resultará en un incremento de la señal amperométrica. En el marco de los procesos que hemos identificado, estudiamos la influencia de la disposición espacial de la GOx adsorbida en una monocapa sobre la comunicación eléctrica entre el mediador y la enzima. En este contexto, mediante medidas de QCM, AFM y técnicas electroquímicas determinamos que el nivel de agregación de proteína sobre la superficie del electrodo incide de manera negativa en la constante de velocidad aparente de la mediación catalítica de la PAH-Os en la oxidación del sustrato de la GOx, β-D-glucosa. Más aún, la cantidad de enzima que interactúa con el mediador es mucho menor a la enzima pesada por QCM. Sin embargo, al aumentar la relación de concentración superficial entre los sitios de Os adsorbidos y la enzima depositada, se incrementaba tanto la cantidad de enzima “cableada” por la PAH-Os como así también la constante de velocidad aparente con el grupo FADH2 de la GOx. El mecanismo de transporte de carga rédox en el sistema PAH-Os / GOx fue estudiado intercalando una capa de GOx activa con capas de apoenzima inactiva, apo-GOx. Ubicando la capa reactiva a distancia variable del electrodo fue posible determinar el coeficiente de difusión de la carga rédox, De, en la estructura electrostática autoensamblada. El valor de De obtenido - en el orden de 10ˉ9 cm² sˉ¹ — implica que el transporte de carga ocurre a través de un mecanismo de saltos electrónicos ya que la difusión fisica de las cadenas poliméricas de la PAH-Os se halla impedida. De esta manera, la construcción capa por capa de estos electrodos permitió definir espacialmente el sistema y estudiar el transporte de carga rédox a lo largo de distancias nanométricas. La posibilidad de propagar la estructura en forma repetida y construir un sistema de multicapas de PAH-Os / GOx permitió establecer similitudes y diferencias entre las distintas capas depositadas. En particular, se encontró que la primer bicapa de PAH-Os / GOx difiere notablemente del resto que le siguen debido a que la PAH-Os interactúa con la enzima únicamente por “debajo”. Por otra parte, al aumentar el pH desde donde se adsorbía la solución de PAH-Os las cantidades de enzima y carga rédox depositadas eran mayores. Esto es debido a que el polielectrolito rédox tiende a adoptar una conformación que expone una mayor proporción de segmentos poliméricos sobre la superficie que inducen la agregación de enzimas. Si bien la proporción de enzimas que reaccionan con la PAH-Os es mayor en este caso, la constante de velocidad permanece relativamente invariable. Exploramos también el uso de un mediador rédox globular de origen dendrítico, PAMAM-Os autoensamblado con la enzima GOx. Los estudios elipsométricos indicaron un ligero comportamiento elástico del dendrímero modificado al adsorberse en forma electrostática sobre una superficie. Más aún, si bien se encontró que la PAMAM-Os participa activamente en el proceso de catálisis de oxidación de la glucosa se encontraron dificultades para definir la concentración volumétrica de sitios de Os en el film. Finalmente, el autoensamblado electrostático permitió analizar la comunicación eléctrica entre la PAH-Os y SBP que posee un centro prostético constituido por un grupo hemo y reduce H2O2 a expensas de los sitios de PAH-Os reducidos. Por otra parte, dado que la GOx en presencia de O2 oxida la glucosa produciendo H2O2, se ensayó un esquema bienzimático donde se depositaron capas de SBP intercaladas con PAH-Os y una capa de GOx en el tope de la estructura. Trabajando a potenciales reductores se registró la respuesta amperométrica debida a la formación de peróxido de hidrógeno por la capa de GOx. En este sentido se logró definir con precisión de nanometros las distintas capas reactivas. En conclusión, los resultados obtenidos sugieren que el estudio de electrodos enzimáticos amperométricos autoensamblados electrostáticamente constituye una poderosa herramienta para analizar distintos aspectos relacionados a la transferencia electrónica entre enzimas y el mediador rédox, los mecanismos de propagación de electrones en sistemas químicos integrados y la distribución espacial de arreglos multienzimáticos.

A biosensor is a molecular recognition device where a biological macromolecule interacts with an analyte in a unique way that triggers a series of events that are finally transduced in an electrical signal. Among this category we can distinguish the enzymatic amperometric electrodes, where an electrical current is measured over a working electrode due to changes in the redox state of a mediator that panicipates in the biocatalytical process. The regeneration of the initial redox state of the mediator over the surface of the electrode — applying appropiate potentials - results in a catalytic steady state and so is the electrical current. This electron flux can be correlated to the analyte consumption. The study of enzymatic amperometric electrodes has always relied in the immobilization of the redox enzymes in a polymer matrix. Unfortunately, this integrated systems present difficulties in their study at a molecular scale because of their complexity and lack of spatial organization of the biosensor. This prevents a microscopic study of the variables that affect the biosensor response, such as thickness, enzyme concentration and redox mediator concentration or the kinetics between enzyme and mediator. In this thesis we propose a strategy for the design of biosensors based on cnzymatic amperometric electrodes. This involves the use of the electrostatic self-assembly in order to adsorb the redox enzyme and mediator in a sequential and alternate process. Using this technique. it is possible to monito different parameters of the sel-assembled system: the amount of enzyme adsorbed, with the quartz crystal microbalance (QCM); the redox sites deposited, can be obtained from electrochemical methods; the film thickness, using ellipsometry and the surface morfology via the atomic force microscopy (AFM). Moreover, the spatial control in the design of the enzymatic amperometric electrode allows to study the performance according to the structure built. In this context, we worked with two anionic redox enzymes: glucose oxidase (GOx) and soybean peroxidase (SBP), while as redox mediators we employed cationic poly(allylamine) modified with an osmium complex. [Os(bpy)2ClpyCHO]¹, (PAH-Os) and polyamidoamine modified with the same complex (PAMAM-Os). In a first stage, we studied the effect of the electrostatic structure on the electrochemical response of the PAH-Os. Given that the film formed is multi-bipolar. ions can be rejected by repulsive electrostatic forces. In this way, the self-assembly of PAH-Os with anionic polyelectrolytes like poly(styrene) sulfonate (PSS) or poly(vinyl) sulfonate (PVS) allowed to model this behavior as a permselective membrane. The positive charges — given by the amino groups — and the negative charges — given by the sulfonate groups — develop a membrane potential that can be interpreted in terms of the Donnan theory. At low ionic strength Donnan permselectivity of anions or cations is apparent and the nature of the ion exclusion from the film is determined by the charge of the topmost layer and solution pH. On the other hand, at high electrolyte concentration Donnan breakdown is observed and the osmium redox potential approaches the value for the redox couple in solution. The electrochemical quartz microbalance has been used to monitor the exchange ofions with the external electrolyte during redox switching. We can recognize three processes associated to the design of a biosensor. First, the electrostatically immobilized redox mediator must exchange electrons with the electrode surface. Second, the redox charge must travel along the successive immobilized layers. Finally, the redox mediator must reach the enzyme redox prosthetic group for electron transfer. This results in the transduction of the molecular recognition of the substrate by the enzyme and in an increase in the amperometric response. Having identified this series of processes, we studied the influence of the spatial distribution of a monolayer of GOx on the electrical communication between the mediator and the enzyme. QCM, AFM and electrochemical studies have shown that the formation of enzyme aggregates on the surface of the electrode lowers the apparent rate constant of the catalytic redox mediation of PAH-Os in the substrate oxidation of GOx, β-D-glucose. Moreover, the amount of enzyme that interacts with the mediator is lower than the enzyme weighed by the QCM. However, increasing the ratio between the surface concentration of Os adsorbed and enzyme deposited increased the amount of enzyme “Wired” by the PAH-Os and the apparent rate constant between the redox mediator and the FADH2 prostethic group. The redox charge transport mechanism in the PAH-Os / GOx system has been studied varying the relative position of the active GOx enzyme layer with inactive apoenzyme layers, apo-GOx. In this order we were able to determine the diffusion coefficient of the redox charge, De, in the electrostatic self assembled structure. The value of De obtained — in the order of lOˉ9 cm² sˉ¹ — implies that the charge transport mechanism proceeds via electron hopping as the physical diffusion of polymeric strands of PAHOS is hindered. Therefore, the layer-by-layer construction of this electrodes allowed to spatially define the system and to analyze the redox charge transport along nanometric distances. The possibility to expand the structure in a repetitive way and to build a system comprised of multilayers of PAH-Os / GOx allowed to establish similarities and differences between the different deposited layers. We found that the first bilayer of PAH-Os / GOx differs from the following layers on top because the PAH-Os only interacts with the enzyme from “below”. In addition, the pH rise of the PAH-Os solution resulted in larger amounts of enzyme and redox mediator deposited. Lowering the charge density of the redox polyelectrolyte induced a surface conformation where more polymer segments are exposed to the solution interface which in turn favored the enzyme aggregation. Despite that, in this case, the fraction of enzymes that react with PAH-Os is bigger the rate constant remains practically invariant. We also explored the use of a dendritic globular redox mediator. PAMAM-Os, self-assembled with GOx. Ellipsometric studies showed an elastic behaviour of the modified dendrimer when was electrostatically adsorbed on a surface. Moreover, we found that PAMAM-Os readily participates in the catalytic oxidation of glucose but the geometric distribution of the redox couple in the film makes difficult the calculation of the volumetric concentration of redox sites. Finally, the electrostatic self-assembly offered the possibility to analyze the electrical communication between PAH-Os and SBP which has an heme prosthetic group. This enzyme and the PAH-Os in the reduced state converts H2O2 to water. On the other hand, it is known that GOx oxidizes glucose to H2O2 in the presence of O2; in this order a bienzymatic scheme was evaluated where layers of SBP were adsorbed with PAH-Os and a layer of GOx on top of the structure. Working at negative potentials the production of H2O2 from the GOx layer was detected recording the amperometric response. In this sense, the precise nanometric control achieved the separation of the reactive layers. In conclusion, the results obtained suggest that the study of enzymatic amperometric electrodes electrostatically self-assembled is a powerful tool for analyzing different aspects related to electron transfer between enzymes and redox mediators, redox charge transports mechanisms in integrated chemical systems and the spatial distribution of multienzyme arrays.

Author affiliation: Wolosiuk, Ricardo Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Las Tiorredoxinas (Trxs) son proteínas que se encuentran en todos los sistemas biológicos y poseen una secuencia muy conservada Cys—Gly-Pro—Cys cuyos tioles reducen los puentes disulfuro de una gran variedad de proteínas. En los cloroplastos de los organismos fotosíntéticos oxigénicos la reducción mediada por la Trx modula la actividad proteica ya que este proceso promueve un cambio conformacional en la enzima sustrato. En esta organela se han caracterizado dos Trxs filogenéticamente distantes: la Trx-m tendría un origen procarióticol mientras que la Trx-f presenta gran homologia con la Trx humana. La Trx-f es particularmente eficiente en la modulación in vitro de la actividad la fructosa-1,6-bisfosfatasa (cFBPasa), mientras que la Trx—m es ineficaz. La disponibilidad de las estructuras tridimensionales de las Trxs de diferentes organismos, su pequeño tamaño, gran solubilidad y termoestabilidad hacen de esta proteína un modelo interesante para el estudio de sus características conformacionales. Uno de los objetivos de este trabajo de tesis fue caracterizar estructural y funcionalmente a la Trx— m, y compararla con la Trx de Escherichia coli. La Trx bacteriana se tomó como referencia ya que ha sido ampliamente estudiada y presenta además un alto porcentaje de identidad con la Trx—m.Por otra parte, si bien todas las Trxs comparten el mecanismo catalítico (el intercambio tiol-disulfuro) interaccionan con diferentes proteínas. Las interacciones no covalentes previas a la formación del disulfuro mixto serían las que determinan la especificidad de la Trx por los diferentes sustratos. En este sentido, se analizó la contribución de las interacciones electrostáticas en el reconocimiento Trx-m . cFBPasa. Para realizar estos estudios se aisló la secuencia codificante de la Trx—m de Brassica napus (colza), se sobreexpresó en un sistema heterólogo y se purificó la proteína recombinante. Los aspectos estructurales y funcionales se analizaron mediante mutagénesis sitio-dirigida. A pesar de la gran homología estructural que tienen la Trx—m y la Trx de E. coli, casi todos los estudios realizados mostraron que poseen diferencias fisicoquímicas y funcionales. La Trx—m fue menos eficiente que la Trx de E. coli en la reducción e isomerización de puentes disulfuro. Por otra parte, si bien las Trxs son muy termoestables la Trx—m es aún más estable que la Trx bacteriana. La mutante W17F Trx-m, que conserva los dos triptofanos próximos a las cisteínas catalíticas, permitió establecer que a pesar de que la Trx-m y la Trx bacteriana mantienen la geometría del sitio activol el entorno de estos triptofanos es distinto. Tanto la Trx—m salvaje como la mutante W17F tienen un rendimiento cuántico menor que la proteína bacteriana y la dependencia de la fluorescencia intrínseca con el pH también es distinta. Por otra parte, la mutante Wl7F permitió identificar que el triptofano l7 en la Trx-m es el residuo que más contribuye a la emisión de la fluorescencia intrínseca de la proreína oxidada y contribuye también al espectro de dicroismo circular en el UV lejano. La importancia del triptofano 17 en el núcleo aromático de la proteína se determinó con el reemplazo por un residuo alifático y pequeño (WWA). Esta mutante modificó no sólo las propiedades estructurales (fluorescencia intrínseca y dicroismo circular en el UV lejano) sino también la estabilidad frente a perturbantes físicos y químicos. y la capacidad reductora (insulina y cFBPasa). La prolina en la posición 35 está estrictamente conservada en las Trxs-m y ausente en todas las otras. El reemplazo de esta prolina aumentó la sensibilidad de la molécula a perturbantes químicos y fisicos. La incorporación de una carga positiva en esa posición (P35K) favoreció la interacción con la cFBPasa, mientras que una carga negativa la empeoró (P35E). Estos resultados son congruentes con la densidad de cargas negativas que rodea a las cisteínas de la cFBPasa sujetas a la regulación redox y al contenido de cargas positivas que rodea el sitio activo de la Trx—f,el modulador más eficiente. Por otra parte. altas concentraciones salinas condujeron a todas la Trxs a valores similares de activación. Como conclusión, la cFBPasa discriminaría a las distintas Trxs por interacciones electrostáticas de largo alcance, que determinarían la diferente eficiencia de las Trxs en la modulación de la actividad de esta enzima. Sin embargo, las interacciones electrostáticas no influirían en la interacción entre la Trx y la malato deshidrogenasa, ya que todas las mutantes en la Pro35 resultaron menos eficientes en la acrivación que la Trx-m salvaje El conjunto de estos resultados no sólo establece la participación de las interacciones electrostáticas sino también revela la contribución de otros factores en la formación del complejo no covalente (Trx-m)reducida/(proteína sustrato)oxidada.

Thioredoxins (Trxs) are found in all biological systems. They have a very conserved sequence Cys-Gly-Pro—Cys whose thiols reduce a wide array of protein disulfide bridges. In chloroplasts of oxygenic photosynthetic organism reduction carried out by Trxs modulate protein activity, as this process promotes conformational changes in proteins. In this organelle two phylogenetically divergent Trxs have been charaCterized: Trx—m of prokaryotic origin, while Trx—fdisplays great homology with human Trx. In vitro. Trx—fis particularly efficient modulating fructose—1,6-bisfosfatase (cFBPase) activity, whereas Trx—m is inefficient. The availability of Trx three-dimensional structures from different species, their small size, great solubility and termostability made them an interesting model for studying their Structure. One of the objectives of this thesis was to characterize Trx-m structurally and functionally, and compare it with Escherichiacoli Trx. Prokaryotic Trx was taken as reference since it has been extensively studied and has high identity with Trx-m. On the other hand, although all Trxs share the same catalytic mechanism (thiol—disulfide exchange), they interact with different proteins. Non covalent interactions prior to the formation of the disulfide mixed would determine the specificity of Trx by different substrates. In this context, electrostatic interactions in Trx-m/cFBPase recognition were analyzed. For these purposes the coding sequence of Brassica napus (rapeseed) Trx-m was determined, and the recombinant protein was overexpressed and purified. The study of functional and structural aspects was followed by a site-directed mutagenesis strategy. In spite of the great structural homology shared by Trx—mand E. coli Trx, almost all the studies carried out showed that they possess physicochemical and functional differences. Trx—m was less efficient than E. coli Trx in reduction and isomerization of disulfide bridges. On the other hand, although Trxs are very stable, our studies showed that Trxm is still more stable than prokaryotic Trx. W17F mutant of Trx—m conserves tryptophans near the catalitic cysteines. This mutant established that in spite of the fact that Trx-m and E. coli Trx maintain the geometry of the active site, the environment of these tryptophans is distinct. Both wild type Trx-m and Wl7F mutant have a lower quantum yield than prokaryotic protein and the intrinsic fluorescence in function of pH shows a different behavior. On the other hand, W17F mutant allowed us to identify that triptophan 17 in Trx-m is the residue that contributes more to the fluorescence emission of oxidized protein and also contributes to UV dicroism circular. The role of Trpl7 in the protein aromatic nucleus was determined replacing Trpl7 with a small and aliphatic residue (W17A). This mutant modified not only the structural properties (intrinsic fluorescence and UV circular dicroism) but also the stability towards physical and chemical perturbants. and reducing capacity (insulin and cFBPase). Proline in position 35 is strictly conserved in Trxs-m and absent in all the other. Replacement of proline enlarged the sensibility of the molecule to chemical and physical perturbants. Incorporation of a positive charge in that position (P35K) favored the interaction with cFBPase. while a negative charge impaired it (P35E). These results are congruent with the great negative density of charges that surround the redox regulating cysteins of cFBPase and the major positive charges that surround the active site of Trx—f,the more efficient modulator. On the other hand, high salt concentration conducted to all Trxs to similar values of activation. As conclusion, cFBPase would discriminate distinct Trxs by long—range electrostatic interactions. which would determine the different efficiency of Trxs in modulating enzyme activity. However, interactions would not influence interaction among Trx and malate dehydrogenase, since all mutants in Pr035 resulted less efficient in activation that wild type Trx—m.These results establish the participation of electrostatic interactions but also reveal the contribution of other factors in the formation of the non covalent complex (Trx-m)reduced/(substrate protein) oxidized.

Author affiliation: Duek, Paula Débora. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.