Abstract:

La FSH se sintetiza y secreta como una familia de variantes glicosiladas, las cuales difieren en el grado de sialilación y complejidad de sus oligosacáridos y en la inducción de respuestas biológicas en células blanco, in vivo e in vitro. El objetivo general de esta Tesis Doctoral fue establecer la relación existente entre las características de los carbohidratos presentes en la molécula de FSH y la inducción de respuestas biológicas en las células de la granulosa. La acción de variantes glicosiladas, aisladas de FSH recombinante humana (FSHrh), fue evaluada in vitro utilizando dos modelos experimentales. Se estudió la producción de inhibinas diméricas en células de la granulosa de rata; de esteroides e inhibinas en la línea celular de granulosa humana, KGN, como así también el patrón de expresión génica global y la expresión de enzimas esteroidogénicas y subunidades de inhibinas. Estudios in vitro demostraron que el grado de sialilación y la complejidad de los oligosacáridos presentes en la FSHrh reguló en forma diferencial la producción de esteroides y péptidos. Asimismo, el análisis de ontología génica reveló la capacidad que poseen las variantes glicosiladas de FSHrh de modular en forma diferencial la expresión de genes involucrados en funciones o procesos esenciales para el mantenimiento de la función celular. Las características de las variantes glicosiladas de la FSH circulante fueron determinadas en condiciones fisiológicas y en pacientes infértiles con ciclos regulares. Se observaron alteraciones en el grado de sialilación de la FSH circulante en las pacientes con trastornos reproductivos y en mujeres jóvenes ovodonantes. Los resultados obtenidos demuestran que los oligosacáridos de la molécula de FSH regulan distintas funciones de la célula de la granulosa. Alteraciones precoces en el grado de sialilación de la gonadotrofina podrían comprometer la capacidad reproductiva en la mujer.

FSH is produced and secreted as a family of glycosylation variants which differ from each other in the oligosaccharide sialylation and complexity and in the induction of different biological responses in vitro and in vivo. The aim of this Doctoral Thesis was to establish the relationship between the FSH carbohydrate characteristics and the induction of biological responses in granulosa cells. The effect of recombinant human FSH glycosylation variants were evaluated in two experimental models in vitro. Dimeric inhibin production was assessed in rat granulosa cells, steroids and inhibin production in human granulosa cell line KGN, as well as global gene expression profile and the expression of steroidogenic enzymes and inhibin subunits. In vitro studies demonstrated that sialylation and complexity of rhFSH oligosaccharides induced a differential regulation of steroid and inhibin production. Gene ontology analysis revealed the ability of rhFSH glycosylation variants to differentially modulate the expression of genes involved in essential cell biological processes and molecular functions. Circulating FSH oligosaccharides characteristics were determined under physiological conditions and in infertile patients. Alterations in FSH sialylation were observed in infertile patients and in ovodonors. The results obtained in this study show that FSH oligosaccharides regulate different functions in granulosa cells. Early alterations in FSH sialylation may jeopardize the reproductive capacity in women.

Author affiliation: Loreti, Rosana Nazareth. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Las inhibinas y activinas, son glicoproteínas diméricas formadas por subunidades α y β. Las inhibinas, producidas en las células de la granulosa en el ovario y en las células de Sertoli (CS) en el testículo, han sido aisladas por su capacidad de inhibir selectivamente la producción de la hormona folículo estimulante (FSH) en el gonadotropo. Las activinas, potentes estimuladores de la síntesis y secreción de FSH, actúan además como factores de crecimiento en distintos tipos celulares. Ambos factores resultan esenciales en la regulación del eje hipotálamo-hipófiso- gonadal. El presente trabajo de Tesis tuvo como objetivo esclarecer, utilizando diferentes modelos experimentales, nuevos mecanismos de regulación involucrados en la expresión de las subunidades de inhibina/activina (α, βA y βB) y la producción de inhibinas y activina A en células ováricas y testiculares. Los resultados obtenidos en cultivos de folículos antrales tempranos de rata, evidenciaron la importancia de la interacción de los distintos tipos celulares para mantener el predominio de la inhibina B en los primeros estadios del desarrollo folicular. Asimismo, permitieron describir el efecto modulador diferencial del entorno esteroideo intrafolicular y su interacción con la FSH sobre la producción de inhibinas y activina A. Un hallazgo particularmente original fue la acción regulatoria del 25-hidroxicolesterol sobre la expresión de estos péptidos. Los estudios realizados en cultivos de CS de rata demostraron que la acción de FSH y de factores paracrinos sobre la producción de inhibinas y activina A varía de acuerdo al grado de maduración de la gonada. En la CS inmadura, factores provenientes de las células peritubulares tendrían un papel importante en el sostenimiento de la alta producción de inhibina B característica de esta etapa del desarrollo. En las CS en estadios avanzados de maduración, la FSH, en forma conjunta con factores provenientes de las células germinales, constituiría el estímulo más relevante para estimular la producción de inhibina B. La FSH se sintetiza y secreta como una familia de variantes de glicosilación, las cuales difieren en la composición de sus oligosacáridos y en la capacidad de inducción de respuestas biológicas. Los estudios in vitro realizados en CS en estadios avanzados de maduración demostraron que el grado de sialilación y complejidad de los oligosacáridos presentes en la FSH sería un factor regulatorio adicional de la producción de inhibinas en la gonada masculina. Finalmente, la incapacidad de producir inhibina B in vivo observada en un paciente con un desorden del desarrollo sexual, impulsó el estudio de factores inhibitorios de la producción de inhibinas en cultivos de túbulos seminíferos humanos y CS de rata. Los resultados obtenidos en el presente trabajo de Tesis contribuyen a esclarecer los mecanismos de regulación de la producción de inhibinas y activina A en la gonada y confirman el valor de estos péptidos como marcadores de la función ovárica y testicular.

Inhibins and activins are structurally related dimeric glycoproteins composed of α and/or β subunits. Inhibins, produced by granulosa cells in the ovaries and in Sertoli cells (SC) in the testes, were isolated on the basis of their capacity to specifically suppress follicle stimulating hormone (FSH) secretion by the gonadotropes. Activins are potent stimulators of FSH synthesis and secretion and they act as growth factors on different cell types. Both peptides are essential for the modulation of the hypothalamic–pituitary–gonadal axis function. The present study was aimed at elucidating, using different in vitro experimental models, new regulatory mechanisms involved in inhibin/activin subunit (α, βA y βB) expression as well as inhibins and activin A production in ovarian and testicular cells. The results obtained in cultured rat early antral follicles, revealed the importance of the interaction among different types of follicular cells to sustain the predominance of inhibin B at early stages of follicular development. Furthermore, the results showed that the complex interplay between FSH and the steroid follicular microenvironment differentially modulate the gene expression of inhibin/activin subunits, their assembly and secretion. In addition, a novel modulatory action of 25-hydroxycholesterol on inhibin/activin follicular expression was described. The studies carried on using rat SC cultures demonstrated that the action of FSH and paracrine factors on inhibin and activina A production varies according to the stage of gonadal maturation. Factors produced by peritubular cells might have an important role in sustaining the high production of inhibin B in the immature SC. At later stages of SC maturation, FSH and factors derived from germ cells, constitute the most relevant stimulus for modulating inhibin B production. FSH is synthesized and secreted as a family of glycosylation variants, which differ in their oligosaccharide composition and in their ability to induce biological responses. The in vitro studies performed in SC at more advanced stages of maturation demonstrated that the sialylation degree as well as the complexity of oligosaccharides present in the FSH molecule should be considered as additional factors in the modulation of inhibin production in the pubertal male gonad. In the last section of this study, the incapacity to produce inhibin B in vivo, observed in a patient with a disorder of sex development, led us to study inhibitory factors of inhibin production in cultured human seminiferous tubules and rat SC. The results obtained herein contribute to deepen the knowledge of the regulatory mechanisms underlying inhibins and activin A production, confirming their usefulness as peripheral markers of ovarian and testicular function from birth to adulthood.

Author affiliation: Andreone, Luz. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.