Abstract:

La tuberculosis bovina (TBB) y la paratuberculosis bovina (PTB) son enfermedades de alta prevalencia en nuestro país. Actualmente, existe una campaña nacional para la erradicación de la TBB debido a su alta prevalencia en rodeos y en animales silvestres, y habida cuenta de que el agente causal se transmite a los seres humanos, constituye un importante problema de salud pública. El método diagnóstico oficialmente aprobado para el control de la TBB y PTB es la intradermorreacción con PPD bovina (PPDb) o PPD aviar (PPDa), respectivamente; sin embargo, y como ocurre en otros países del mundo, se han planteado pruebas alternativas que ayudarían a mejorar el diagnóstico y, por ende, el control de estas enfermedades. Entre las pruebas paralelas a la oficial, la detección de IFNg es una de las opciones más viables. En este contexto, nos hemos propuesto desarrollar un test diagnóstico para ambas enfermedades basado en la detección y cuantificación in vitro de IFNg generado luego de la estimulación de células de sangre periférica con antígenos específicos. El abordaje de este desarrollo contribuirá significativamente a las estrategias de control de la TBB y PTB con un producto de desarrollo nacional, innovador y de un costo accesible.

This project aims to develop diagnostic tests for tuberculosis (TBB) and paratuberculosis (PTB) in cattle based on detection and quantification of the in vitro production of gIFN that is generated after stimulation of peripheral blood cells with specific antigens. The TBB and PTB are two diseases of high prevalence in our country that generate significant economic losses. Moreover, these diseases are a public health problem, as the TBB is spread from animals to humans and there is some evidence to suggest that the bacteria causing PTB is associated with Crohn’s disease in humans. The officially diagnostic test approved by Senasa is the skin test; however, alternative and parallel tests could improve the diagnosis of these diseases, being the detection of gIFN one of the most viable options. Therefore, the development and production of the tests proposed here will contribute significantly to the control strategies of TBB and PTB with a national product accessible in economic terms.

Author affiliation: Forrellad, Marina Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina

Author affiliation: Zabal, Osvaldo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina

Author affiliation: Blanco, Federico Carlos. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina

Author affiliation: Garcia, Elizabeth Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina

Author affiliation: Rocha, Rosana V.. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina

Author affiliation: Romano, Maria Isabel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina

Author affiliation: Taboga, Oscar Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina

Author affiliation: Bigi, Fabiana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina

Abstract:

La reacción de hipersensibilidad retardada (DTH) producida por la aplicación intradérmica del derivado proteico purificado de una cepa de M. bovis (PPD-B) y la prueba que mide liberación de interferón-gamma (IFN-ϒ) son usadas para el diagnóstico de tuberculosis bovina (TBB). La especificidad de estas pruebas puede verse comprometida si se utiliza PPD-B, debido a reaccionantes positivos por sensibilización con otras micobacterias. En el presente estudio evaluamos dichas pruebas con dos mezclas conteniendo proteínas recombinantes de M. bovis: Mezcla 1 (M1): con ESAT-6, CFP-10 y MPB83; y mezcla 2 (M2): con ESAT-6, CFP-10, MPB83, HspX, TB10:3 y MPB70. Las mezclas M1, M2 y PPD-B aplicadas intradérmicamente en cobayos sensibilizados con M. bovis mostraron respuestas similares. Sin embargo, M1 indujo una reacción significativamente menor que la PPD-B en cobayos sensibilizados con M. avium. En bovinos, utilizando M1 en la prueba de IFN-γ se obtuvo mayor especificidad que con PPD-B o M2, dado que M1 fue mínimamente detectada por animales con paratuberculosis (PTB) o experimentalmente vacunados con BCG. Para optimizar estas mezclas, se obtuvieron diferentes fracciones de las PPD-B identificándose 7 proteínas en aquellas fracciones más inmunogénicas: MPB70, MPB83, CFP10, CFP2, FixB, PepA y HspX. Al utilizar M1 con FixB en la prueba de IFN-γ aumentó el reconocimiento de animales en un rodeo con TBB, sin reaccionar animales de un rodeo con PTB. Nuestros resultados demuestran que esta nueva mezcla antigénica es detectada específicamente por animales con TBB, mientras que el reactivo PPD-B fue detectado por animales infectados con otras micobacterias.

The delayed type hypersensitivity skin test (DTH) and the interferon-gamma (IFN-γ) assay are used for the diagnosis of bovine tuberculosis (TBB). However, the specificity of these tests is compromised because both are based on the response against purified protein derivative of Mycobacterium bovis (PPD-B). In the current study, we assessed the potential of two cocktails with M. bovis recombinant proteins: Cocktail 1 (C1) contained ESAT-6, CFP-10 and MPB83, and cocktail 2 (C2) with ESAT-6, CFP-10, MPB83, HspX, TB10:3 and MPB70. C1, C2 and PPD-B showed similar response by DTH in M. bovis-sensitized guinea pigs. Importantly, C1 induced a significantly lower response than PPD-B in M. avium-sensitized guinea pigs. In cattle, C1 had better performance diagnostic than PPD-B and even than C2 by IFN-γ assay; indeed, C1 detected animals with TBB, with the least detection of animals either vaccinated with BCG or with paratuberculosis. For an optimization of the cocktails, we obtained different protein fractions of PPD-B and tested them in experimentally M. bovis-infected cattle. In a fraction highly reactive seven proteins were identified: MPB70, MPB83, CFP10, CFP2, FixB, PepA and HspX. The inclusion of FixB in C1 enhanced the recognition of naturally M. bovis-infected cattle by IFN-γ assay without compromising specificity. Our data provide a promising basis for the future development of a cocktail for detection of TBB without interference by the presence of animals sensitized or infected with other mycobacteria.

Author affiliation: Mon, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina

Author affiliation: Moyano, Roberto Damian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina

Author affiliation: Viale, Mariana Noelia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina

Author affiliation: Colombatti Olivieri, María Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Norte. Estación Experimental Agropecuaria Delta del Paraná; Argentina

Author affiliation: Gamietea, Ignacio. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria; Argentina

Author affiliation: Alonso, Bernardo. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina

Author affiliation: Santangelo, María de la Paz. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina

Author affiliation: Romano, Maria Isabel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina