Abstract:

The identification of a second regulatory checkpoint controlling RNA polymerase II elongation near the poly(A) site of protein-coding genes reveals an additional level of complexity in the modulation of eukaryotic transcriptional elongation and termination.

Author affiliation: Giono, Luciana Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina

Author affiliation: Kornblihtt, Alberto Rodolfo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina

Abstract:

El Mal de Rio Cuarto es la principal enfermedad del maíz en la Argentina. Es causado por el Mal de Río Cuarto virus (MRCV) y transmitido por una chicharrita de la especie Delphacodes kuscheli. El MRCV pertenece a la familia Reoviridae, género Fijivirus, y tiene la propiedad de multiplicar tanto en plantas de maíz como en el insecto vector. Las particulas virales consisten en una cápside icosahédrica formada por una doble capa de proteínas y contiene en su interior lO segmentos genómicos de RNA de doble cadena (dsRNA) llamados Sl a SlO, siendo el tamaño del genoma de aproximadamente 29 kbp. En los últimos años, y en muchos casos en paralelo con el desarrollo de éste trabajo, se han reportado las secuencias de algunos segmentos de virus relacionados: el MRDV (Maize rough dwarf virus), el FDV (Fiji disease virus), el ODSV (Oat sterile dwarf virus), el genoma completo del RBSDV (Rice black streaked dwarf virus) y del NLRV (Nilaparvata lugens reovirus). En este trabajo se clonaron, secuenciaron y analizaron los segmentos genómicos Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 y SlO completos del MRCV. Se determinó que todos los segmentos genómicos analizados poseen secuencias 5’ y 3’ terminales conservadas y características del serogrupo al cual pertenece el MRCV: 5’AAGUUUUU3’ (extremo 5’) y 5’CAGCUnnnGUC3’ (extremo 3’). Adyacente a los extremos conservados se encuentran repeticiones de 7 a 12 nucleótidos invertidas e imperfectas que son segmento específicas. La predicción de la estructura secundaria de las cadenas codificantes de todos los segmentos estudiados, muestra que las regiones terminales son capaces de formar estructuras secundarias determinadas y estables que fueron propuestas como señales de replicación y empaquetamiento en virus del género Rotavirus. Se compararon las secuencias de nucleótidos obtenidas y las secuencias de aminoácidos deducidas con las secuencias de otros reovirus depositadas en las bases de datos, y se identificó la presencia de motivos característicos, a menudo indicativos de función. Se determinó que el MRCV Sl codifica para una proteína básica de 168,4 kDa que contiene motivos conservados en las RNA polimerasas dependientes de RNA y es homóloga a las RNA polimerasas codificadas por los virus RBSDV, FDV y NLRV, asi como a las codificadas por miembros de otros géneros de la familia Reoviridae. El MRCV S2 codifica para una proteína de 134,4 kDa y posee homología con las proteínas codificadas por el RBSDV S4, el FDV S2 y NLRV S2. En este trabajo presentamos evidencias de que la proteína codificada en éste segmento es no estructural. El MRCV S3 codifica para una proteína de 141,7 kDa, y hemos demostrado que es la proteína mayoritaria de la cápside interna o “core” viral y posee una alta homología con las proteínas correspondientes codificadas por el RBSDV S2 y FDV S3. El MRCV S4 codifica para una proteina de 131,7 kDa y su función se desconoce. Presenta una relativamente alta homología con miembros del género Fijivirus como así también con otros miembros de la familia Reoviridae. El MRCV S5 codifica para una proteína de 106,9 kDa cuya función se desconoce. Esta proteína presenta homología con las proteínas codificadas por los segmentos S5 del RBSDV y del FDV. El MRCV S6 codifica para una proteína de 90 kDa cuya función se desconoce. Esta proteína presenta una llamativa baja homología con las proteínas codificadas por los segmentos S6 del RBSDV y del FDV. El MRCV S8 codifica para una proteína de 68,3 kDa que contiene un motivo de unión de ATP/GTP que es característico de helicasa. Además la proteína es homóloga con las proteínas codificadas por el RBSDV S8, el MRDV S7, el OSDV S9 y el NLRV S7, todas con probable función de helicasa. El MRCV SlO codifica para una proteína de 63,5 kDa y su probable función sería la de proteína de cápside externa. Esta proteína presenta una alta homología con las proteínas correspondientes codificadas por los segmentos SlO de los virus RBSDV, MRDV y FDV. El análisis de los valores de homología encontrados entre los distintos segmentos del MRCV y los segmentos de virus relacionados, apoyaría la idea de evolución independiente de cada segmento viral. El análisis filogenético realizado con las secuencias obtenidas del MRCV permitió proponer que a pesar de que el MRCV está relacionado con el MRDV y el RBSDV, debe ser considerado una especie diferente del género Fijivirus (Distéfano y col., 2002) y no una raza geográfica del MRDV, como había sido inicialmente propuesto. El análisis filogenético realizado con las secuencias de aminoácidos de polimerasas representativas de todos los géneros de la familia Reoviridae mostró la existencia de dos grupos evolutivos separados: uno agrupa a los Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus y Rotavirus, y otro agrupa a los Fijivirus, Cypovirus, Olyzavirus y Coltivirus. Se expresaron algunos de los segmentos virales en estudio en bacterias obteniéndose proteínas de fusión con un péptido rico en histidinas que facilita su posterior purificación. Se obtuvieron antisueros policlonales contra las proteínas codificadas por los segmentos S2, S3, S4 y S6. El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 fue capaz de reconocer específicamente una de las proteína estructurales presentes en partículas virales purificadas del MRCV en un ensayo de “Western blot”. Esta proteina correspondería a la proteína mayoritaria de la cápside interna o “core” viral. En un experimento complementario, un antisuero obtenido contra las proteínas de la partícula viral fue capaz de reconocer a la proteína del MRCV S3 expresada en bacterias. Asimismo el antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV S3 reconoce una proteína de tamaño similar al esperado en extractos de plantas enfermas. Mediante experimentos de inmunomicroscopía electrónica sobre cortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV se confirmó que la proteína codificada por el S3 del MRCV es una proteína estructural del virus y se demostró que forma parte del “core” viral El antisuero obtenido contra la proteína codificada por el MRCV 82, reconoció específicamente a una proteína de menor tamaño al esperado en extractos proteicos totales de plantas enfermas. Mediante experimentos de inmunomicroscopía electrónica sobre cortes de hojas de maíz infectadas el con MRCV se confirmó que la proteína codificada por el S2 del MRCV seria una proteína no estructural presente en los viroplasmas. En experimentos de “Far-Western blot” se observó que la proteína codificada por el MRCV S3 era capaz de interactuar consigo misma, con una proteína de 130 kDa que correspondería a la espícula viral de tipo B y con la RNA polimerasa dependiente de RNA codificada por el MRCV Sl. En Rotavirus se demostró que las proteínas equivalentes interaccionan entre sí. Los resultados presentados en este trabajo contribuyeron al avance en el estudio del virus que causa la enfermedad del Mal de Río Cuarto, a la clasificación taxonómica del mismo y al estudio de su origen evolutivo. Además los datos obtenidos permitieron el diseño de una estrategia de resistencia al MRCV en plantas transgénicas de maíz basada en el desencadenamiento del silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS).

Mal de Río Cuarto is the most important maize disease in Argentina. lt is caused by the Mal de Río Cuarto virus (MRCV) and transmitted by the planthopper Delphacodes kuschell. MRCV belongs to the Reoviridae family, Fijivirus genus, and has the interesting feature of being able to multiply both phloem cells of maize plants and in vector insects. The viral icosahedral double-shelled particles contain lO double-stranded RNA segments (dsRNA) called Sl -SlO, with a total genome size of nearly 29 kbp. In the last years, and in many cases simultaneously with this work, the nucleotide sequences of some Fijivirus genome segments have been reported: MRDV (Maize rough dwarf virus), FDV (Fiji disease virus) and ODSV (0at sterile dwarf virus). In addition the entire RBSDV (Rice black streaked dwarf virus) and NLRV (Nilaparvata lugens reovirus) has been published. This work reports the cloning, sequence and analysis of the genomic nucleotide sequences of MRCV Sl, S2, S3, S4, S5, S6, S8 and SlO. All the analyzed segments have the conserved 5’ and 3’ ends that were reported for viruses of the same serogroup to which MRCV belongs: 5’AAGUUUUU3’ and 5’CAGCUnnnGUC3’, respectively. In addition segment-specific imperfect inverted repeats of 7-12 nucleotides were identified immediately adjacent to the conserved sequences. Prediction of the secondary structure of all segments coding strands showed that terminal regions were able to form defined and stable secondary structures that are proposed to be replication and packaging signals in Rotavirus. We compared their nucleotide and amino acidic sequences with the ones deposited in Genebank for other reoviruses. MRCV Sl potentially encodes a 168.4 kDa basic protein that contains RdRp distinctive motifs and has identity with the RdRps encoded by RBSDV, FDV and NLRV as well as with RNA polimerases coded by virus belonging to other genera of the Reovirdae family. MRCV S2 encodes a single 134.4 kDa protein which has and intermediate identity to RBSDV S4, FDV S2 and NLRV S2-encoded proteins. In this work we showed that the protein coded by this segment is a non-structural protein. MRCV S3 codes for a l4l .7 kDa protein and we demonstrated that is the major core protein and has an extremely high homology with the proteins coded by RBSDV S2 and FDV S3. MRCV S4 codes for a 131.7 kDa protein and its function is unknown. It shows identity to members of Fijivirus as well as to two other genera of the Reoviridae family. MRCV S5 codes for a 106.9 kDa protein and its function is unknown. It shows identity with RBSDV SS and FDV S5-encoded protein. MRCV S6 codes for a 90 kDa protein and its function is unknown. It has a very low homology with the proteins coded by RBSDV S6 and FDV S6. MRCV SBcodes for a 68.3 kDa protein Significantly, MRCV S8 encoded protein contains an ATP/GTP-binding site motif that is a common feature of dsRNA helicases. In addition, MRCV S8 revealed identity with the proteins coded by RBSDV S8, MRDV S7, OSDV S9 and NLRV S7, all of them with proposed helicase function. MRCV SlO codes for a 63.5 kDa protein that probably corresponds to the outer capsid protein. This protein shows a high identity with the proteins coded by RBSDV SlO, MRDV SlO and FDV SlO. The comparative level of homology between different MRCV encoded proteins varied noticeably, supporting an independent evolution of the different genome segments. We discussed the evolutionary relationships of MRCV to other Reoviridae, and based on phylogenetic analysis we proposed that although MRCV is related to MRDV and RBSDV, it could be regarded as a new species of the Fijivirus genus and not a geographic race of MRDV as it was previously proposed. Phylogenetic analysis based on RdRps amimo acidic sequences of viruses belonging to all the genus of the Reoviridae family, showed the existence of two major evolutionary divisions of polymerase proteins among them: one grouped Orthoreovirus, Aquareovirus, Orbivirus and Rotavirus, and the second one grouped Fijivirus, Cypovirus , Oryzavirus and Coltivirus. Some of the studied segments were expressed in bacteria as fusion proteins with an histidine-rich peptide. Polyclonal antibodies were raised against S2, S3, S4 and S6 coded proteins. The antiserum obtained against the protein coded by MRCV S3 was able to specifically recognize a single structural protein present in the purified virus particles in a Western blot assay and a 140 kDa protein present in infected plants. This protein corresponds to the major core protein. On the other side, a polyclonal antiserum against the purified virus particle was able to recognize a MRCV S3 fusion protein expressed in bacteria. Inmuno-electron microscopy revealed that antiserum against the protein coded by MRCV S3 reacted with viral cores. The antiserum obtained against the protein coded by MRCV S2 was able to specifically detect a single protein of a smaller size as predicted in total proteins extracts from infected maize plants. Inmuno-electron microscopy revealed that antiserum against the protein coded by MRCV S2 reacted with viroplasms present in the phloem cells of infected maize plants. “Far-Westem blot” experiments showed that MRCV S3 coded protein interacts with itself with a protein of l30 kDa that probably correspond to the B-spike and with the RNA dependent RNA polimerase encoded by MRCV Sl. In Rotavirus the correspondent proteins also interact. The results showed in this work contribute to the understanding of the virus that cause Mal de Rio Cuarto disease, helped redefine the virus taxonomic classification within the genera, and collaborated with the determination of the evolutionary origin of the fijivirus genus. Also these results allowed to the design of a MRCV resistance strategy in trasgenic maize plants based on the triggering of post-transcriptional gene silencing (PTGS).

Author affiliation: Distéfano, Ana Julia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Coupling of transcription and alternative splicing via regulation of the transcriptional elongation rate is a well-studied phenomenon. Template features that act as roadblocks for the progression of RNA polymerase II comprise histone modifications and variants, DNA-interacting proteins and chromatin compaction. These may affect alternative splicing decisions by inducing pauses or decreasing elongation rate that change the time-window for splicing regulatory sequences to be recognized. Herein we discuss the evidence supporting the influence of template structural modifications on transcription and splicing, and provide insights about possible roles of non-B DNA conformations on the regulation of alternative splicing.

Author affiliation: Nieto Moreno, Nicolás. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina

Author affiliation: Giono, Luciana Eugenia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina

Author affiliation: Cambindo Botto, Adrian Edgardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina

Author affiliation: Muñoz, Manuel Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina

Author affiliation: Kornblihtt, Alberto Rodolfo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina

Abstract:

El virus de la Fiebre Afiosa (VFA), un Aftovirus de la familia Picornaviridae, es el agente causal de una enfermedad altamente contagiosa y de tremenda importancia económica, que afecta al ganado de pezuña hendida. La diferenciación entre animales infectados y vacunados así como la detección de animales portadores del virus o “carriers” es esencial para evaluar la efectividad de campañas de control y erradicación. La detección de anticuerpos (Ac) contra un antígeno (Ag) no estructural asociado con la replicación del virus, el Ag Asociado a la Infección Viral (Ag VIA), cuyo componente principal es la ARN polimerasa o proteína 3D, altamente conservada entre los diferentes serotipos, ha sido una herramienta útil para monitorear programas de control y erradicación, como un indicador indirecto para la evaluación de la actividad viral a nivel poblacional. Es conocido que vacunas inactivadas contra el VFA pueden inducir Ac contra el Ag VIA, si bien los niveles de estos Ac son muy bajos y su permanencia mas corta que en animales infectados. Esta respuesta transitoria y variable se atribuye a la presencia de restos de la polimerasa viral en el Ag vacunal, el cual sería antigénico y resultaría en la producción de Ac contra el Ag VIA. El método más ampliamente utilizado para medir Ac contra el Ag VIA es la Inmunodifusión en Agar Gel (IDAG). Este método es simple de realizar, pero su baja sensibilidad y el uso de un Ag parcialmente purificado derivado de cultivos infectados con el virus, llevó al desarrollo de otras metodologías. Con el objeto de sobrellevar estos inconvenientes, se desarrollaron ensayos inmunológicos capaces de detectar Ac contra proteínas no estructurales del VFA, para la identificación de animales infectados con el virus. Las proteínas no estructurales, 3D y 2C, se expresaron en Escherichia coli, como proteínas de fusión a glutation-S-transferasa (GST). Se desarrolló un método de ELISA en fase-líquida (ELISA-3D) capaz de detectar Ac específicos contra la proteína 3D o RNA polimerasa del VFA. El ELISA-3D, fue capaz de detectar Ac contra la proteína 3D en suero de bovinos luego de una infección natural o experimental, desde los 5 días postinfección (dpi) hasta los 565 dpi, mientras que sueros de bovinos provenientes de zona libre de Fiebre Aftosa, así como sueros de referencia de bovinos y porcinos infectados con diferentes virus ARN y ADN, fueron negativos, resultando en una especificidad del 100%. Los resultados de la comparación del ELISA-3D con la técnica de IDAG y con un ELISA-VIA descripto previamente (Alonso y col., 1990), los que utilizan el Ag VIA semipurificado, mostraron que el ELISA-3D es altamente sensible (95.2 %), específico (100%) y reproducíble (C.V. 2.75 %). Los ensayos en sueros de animales vacunados, mostraron una respuesta transitoria de Ac inducida por algunas vacunas. La evaluación del método de “Western blot” utilizando como Ag la proteína no estructural 2C, mostró una reacción positiva cuando se analizaron sueros de bovinos infectados, mientras que sueros de bovinos de zona libre no mostraron ninguna reactividad. El estudio de sueros de bovinos vacunados mostró 1/79 sueros con reactividad positiva para Ac contra 2C. Estos resultados indican que el método de ELISA-3D, es recomendable para ser utilizado como método complementario en estudios seroepidemiológicos para monitorear actividad viral. La respuesta de Ac contra 3D inducida por la vacunación en animales con una o dos vacunaciones es transitoria. El aumento en la frecuencia de reacciones positivas luego de la revacunación, indica que para el monitoreo de actividad viral en planes de control bajo vacunación, es necesario considerar los parámetros de reacción postvacunal contra 3D para una mejor interpretación de los resultados obtenidos por éstas técnicas. Finalmente, el uso de proteínas biosintéticas tiene ventajas en su estabilidad y pureza, evita el manejo de virus vivo y provee una fuente consistente de Ag. La detección de Ac contra otras proteínas no estructurales del VFA, como es el caso de 2C, proveería un mayor grado de confianza en la identificación de animales infectados con VFA.

Foot-and-mouth disease virus (FMDV), an Aphtovirus of the Picomaviridae family, is the causal agent of a highly contagious and economically important disease of cloven-hooved animals. Differentiation between infected and vaccinated animals and the detection of carriers animals are essential to evaluate the effectiveness of control and eradication campaigns. Detection of antibodies against a non-structural antigen associated with the replication of the virus, the virus-infection-associated (VIA) antigen, the main component of which is the viral RNA polymerase or 3D protein, highly conserved among all serotypes, has been a useful tool in monitoring control and eradication programmes, as an indirect indicator of viral activity at the population level. It is well known that inactivated vaccines against FMDV can induce antibodies against the VIA antigen, although the levels of antibodies and their persistence are lower than in infected animals. This transitory and variable response is attribuited to the presence of traces of the viral polymerase in the vaccine antigen, which could be antigenic and result in the production of antibodies against the VIA antigen. The most widely used method for measuring antibody to the VIA antigen is the Agar Gel Immunodiffusion (AGID). The method is simple to perform, but its low sensitivity and the use of partially purified antigen derived from infected cell cultures, made necesary the development of other methods. With the aim of overcome this difficulties, immunochemical assays were developed, able to detect antibodies against FIVHDV non-structural proteins for the identification of infected animals with the virus. Recombinant non-structural proteins, 3D and 2C, were expressed in Escherichia coli, as fusion proteins with glutathione-S-transferase (GST). A liquid-phase blocking sandwich ELISA assay (ELISA-3D) able to detect specific antibodies to the 3D protein or RNA polymerase of FMDV was developed. The ELISA-3D, was able to detect antibodies against the 3D protein in cattle sera after natural or experimental infection as early as 5 days postinfection (dpi) and at later stages, 565 dpi, whereas sera from naive cattle from the FMD free area as bovine and porcine reference sera raised against different RNA and DNA viruses were negative, resulting in a specificity of 100%. Comparison of the ELISA-3D with the AGID and the ELISA-VIA previously described (Alonso et al., 1990), which used the semipurified VIA antigen, shows that the ELISA-3D is highly sensitive (95.2%), specific (100%) and reproducible (C.V. 2.75%). Assays in vaccinated cattle sera, demostrated a transitory antibody response induced by some vaccines. The evaluation of the “Western blot”, using as antigen the non-structural 2C protein, shows a positive reaction with sera from infected cattle, whereas sera from naive cattle from FMDV free area did not react. One of 79 sera from vaccinated cattle shows a positive antibody reaction against 2C. The results obtained here indicate that the ELISA-3D method must be used as a complementary method for seroepidemiological studies for monitoring viral activity. Antibody response to 3D induce in vaccinated or revaccinated animals was transient. The increase in the frequency of positive reactions after revaccination, suggest that to monitor viral activity in control programmes under vaccination, it is necessary to take into account the parameters of the post-vaccination anti-3D response, to make a better evaluation of the results obtained. Finally, the use of bioengineered proteins has advantages such as stability and purity, it does not require handling infective virus and provied a consistent source of antigen. The detection of antibodies to other non-structural proteins, as 2C, provides confirmatory evidence for the identification of FMDV infected animals.

Author affiliation: O’Donnell, Vivian K.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

The mechanism by which viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRp) specifically amplify viral genomes is still unclear. In the case of flaviviruses, a model has been proposed that involves the recognition of an RNA element present at the viral 5' untranslated region, stem-loop A (SLA), that serves as a promoter for NS5 polymerase binding and activity. Here, we investigated requirements for specific promoter-dependent RNA synthesis of the dengue virus NS5 protein. Using mutated purified NS5 recombinant proteins and infectious viral RNAs, we analyzed the requirement of specific amino acids of the RdRp domain on polymerase activity and viral replication. A battery of 19 mutants was designed and analyzed. By measuring polymerase activity using nonspecific poly(rC) templates or specific viral RNA molecules, we identified four mutants with impaired polymerase activity. Viral full-length RNAs carrying these mutations were found to be unable to replicate in cell culture. Interestingly, one recombinant NS5 protein carrying the mutations K456A and K457A located in the F1 motif lacked RNA synthesis dependent on the SLA promoter but displayed high activity using a poly(rC) template. Promoter RNA binding of this NS5 mutant was unaffected while de novo RNA synthesis was abolished. Furthermore, the mutant maintained RNA elongation activity, indicating a role of the F1 region in promoter-dependent initiation. In addition, four NS5 mutants were selected to have polymerase activity in the recombinant protein but delayed or impaired virus replication when introduced into an infectious clone, suggesting a role of these amino acids in other functions of NS5. This work provides new molecular insights on the specific RNA synthesis activity of the dengue virus NS5 polymerase.

Author affiliation: Iglesias, Nestor Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquimicas de Buenos Aires; Argentina. Fundación Instituto Leloir; Argentina

Author affiliation: Filomatori, Claudia Veronica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquimicas de Buenos Aires; Argentina. Fundación Instituto Leloir; Argentina

Author affiliation: Gamarnik, Andrea Vanesa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquimicas de Buenos Aires; Argentina. Fundación Instituto Leloir; Argentina

Abstract:

El splicing alternativo amplía las posibilidades de expresión génica a partir de un número limitado de genes. El splicing está funcionalmente acoplado a la transcripción, y la velocidad de elongación de la ARN Polimerasa II (Pol II) regula algunos eventos de splicing alternativo. Se postula que una menor velocidad de elongación favorece el reconocimiento de sitios débiles por la maquinaria de splicing antes de la síntesis de sitios fuertes competidores río abajo. El exón alternativo EDI de fibronectina está río abajo de un sitio 3’ subóptimo y su inclusión aumenta en situaciones de baja elongación; esto puede deberse a que el reconocimiento del sitio débil antes de la síntesis del sitio fuerte en el intrón siguiente lleva a la escisión del intrón con el sitio débil, forzando la posterior inclusión. Aplicamos una estrategia para estudiar del orden de remoción de los intrones que rodean a un exón determinado. Estudiamos un exón con inclusión reprimida por elongación (EDI), un exón que baja su inclusión a menor elongación (CFTR9), un exón alternativo que no responde a elongación (EDII) y un exón constitutivo (E28). El orden de remoción de intrones se modifica según la línea celular, la presencia de mutaciones en cis o la abundancia diferencial de factores reguladores, pero no se modifica por cambios en la elongación asociados a cambios en la inclusión de EDI. Los resultados sugieren un nuevo mecanismo de regulación de la inclusión de CFTR9 y nos obligan a replantearnos nuestro modelo de regulación cinética de EDI. Aplicamos un método para medir la elongación de Pol II in vivo en genes particulares, y comprobamos que la camptotecina baja la velocidad de transcripción de fibronectina. Medimos el reclutamiento de U2AF65 al sitio débil de EDI y al sitio fuerte río abajo en células tratadas con camptotecina y en células control y observamos un aumento de la unión de U2AF65 al sitio débil con respecto a la unión al sitio fuerte en las células tratadas. Comprobamos así que una menor elongación favorece el reconocimiento por la maquinaria de splicing del sitio débil a expensas del sitio fuerte, y la posterior inclusión del exón independientemente de la cinética de remoción de intrones.

Alternative splicing broadens the scope of genic expression from a limited set of genes. Splicing is functionally coupled to transcription, and the rate of RNA Polymerase II (Pol II) elongation modifies the outcome of some alternative splicing events. A hypothesis holds that slower elongation favours the recruitment of the splicing machinery to weak regulatory sites before the synthesis of strong competing sites downstream of them. Human fibronectin alternative exon EDI starts downstream of a suboptimal 3’ splite site, and its inclusion is enhanced under slow elongation; this may be due to an enhanced recognition of the weak site before the strong site is synthetised, leading to the excision of the upstream intron harbouring the weak splice site and ultimately to exon inclusion. We have used a strategy for determining the order of intron removal around a particular exon. We have studied an exon with a level of inclusion inversely proportional to elongation (EDI), an exon with lower inclusion in slow elongation (CFTR9), an alternative exon unresponsive to elongation (EDII) and a constitutive exon (FN E28). The order of intron removal changes with cell line, cis mutations or regulatory factor abundance, but it is not modified by changes in elongation rate associated with EDI inclusion enhancement. Our intron removal experiments have suggested the existence of a new mechanism for CFTR9 inclusion and they have also made us rethink our model of EDI kinetic regulation. We have successfully applied a method for measuring Pol II elongation rates in vivo in any endogenous gene, and we have found that, as it was expected, camptothecin treatment slows transcription rate on the fibronectin gene. We have measured U2AF65 recruitment to the weak splice site upstream of EDI in camptothecin treated versus control cells and we have detected an increase of U2AF65 binding to the weak site compared to the strong site in camptothecin treated cells. In this way we have ascertained that slower elongation favours the recognition of the weak splice site at the expense of the strong splice site, thereby favouring exon inclusion independently of intron removal kinetics.

Author affiliation: Lafaille, Celina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Las modificaciones epigenéticas son cruciales para el establecimiento y mantenimiento de programas de diferenciación celular. Un posible mecanismo de regulación está determinado por el efecto de la estructura de la cromatina en los patrones de splicing alternativo. Las marcas epigenéticas pueden provocar cambios en la tasa de elongación de la ARN polimerasa II, así como afectar el reclutamiento de diversos factores y, de esta manera, modular los patrones de splicing alternativo. Aquí descubrimos el mecanismo por el cual el splicing alternativo de la molécula de adhesión celular neural (NCAM) es regulado durante la diferenciación neuronal mediante la estructura cromatínica. Por otra parte, nos centramos en la regulación del splicing alternativo de G9a, la enzima responsable de la dimetilación en lisina 9 de histona H3 (H3K9me2) en eucromatina de mamíferos. Demostramos que G9a es necesaria para la diferenciación de la línea celular neuronal de ratón N2a y que la inclusión de su exón alternativo (E10) aumenta la localización nuclear de G9a, probablemente debido a la mayor exposición de una secuencia de localización nuclear cercana. Por último, mostramos que la isoforma de G9a que incluye el E10 es necesaria para la diferenciación neuronal y que regula el patrón de splicing alternativo de su propio ARN mensajero precursor promoviendo una mayor inclusión del E10. Nuestros resultados indican que, mediante el control de su splicing alternativo, G9a promueve la diferenciación neuronal y gatilla un mecanismo de retroalimentación positiva que reafirma el compromiso a la diferenciación celular.

Epigenetic modifications are critical for the establishment and maintenance of differentiation programs. One possible mechanism of regulation is determined by the effect of chromatin structure on alternative splicing patterns. Epigenetic marks can cause changes in elongation rate of RNA polymerase II, as well as affect the recruitment of different factors, and thus modulate alternative splicing choices. Here we discovered the mechanism by which the alternative splicing of the neural cell adhesion molecule (NCAM) is regulated during neuronal differentiation by chromatin structure. Moreover, we focused on the regulation of G9a alternative splicing, the enzyme responsible for dimethylation of lysine 9 in histone H3 (H3K9me2) in mammalian euchromatin. We demonstrate here that the G9a methyltransferase is required for differentiation of the mouse neuronal cell line N2a and that inclusion of its alternative exon 10 (E10) increases during neuronal differentiation of cultured cells, as well as in the developing mouse brain. Although E10 inclusion greatly stimulates overall H3K9me2 levels, it does not affect G9a catalytic activity. Instead, E10 increases G9a nuclear localization, predictably due to higher exposure of a neighboring nuclear localization signal. We show that G9a inclusion of E10 isoform is necessary for neuron differentiation and regulates the alternative splicing pattern of its own pre-mRNA, enhancing E10 inclusion. Overall, our findings indicate that, by regulating its own alternative splicing, G9a promotes neuron differentiation and creates a positive feedback loop that reinforces the cellular commitment to differentiation.

Author affiliation: Fiszbein, Ana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

A series of N4-arylsubstituted thiosemicarbazones derived from 1-indanones and a set of compounds lacking such substitution in the N4 position of the thiosemicarbazone moiety were synthesized and evaluated for their anti-bovine viral diarrhea virus (BVDV) activity. Among these, derivatives 2 and 15 displayed high activity (EC50 = 2.7 ± 0.4 and 0.7 ± 0.1 µM, respectively) as inhibitors of BVDV replication. Novel key structural features related to the anti-BVDV activity were identified by structure-activity relationship (SAR) analysis. In a previous study, the thiosemicarbazone of 5,6-dimethoxy-1-indanone (5,6-TSC) was characterized as a non-nucleoside inhibitor (NNI) of the BVDV RNA-dependent RNA polymerase. In the present work, cross-resistance assays were performed with the most active compounds. Such studies were carried out on 5,6-TSC resistant BVDV (BVDV-TSCr T1) carrying mutations in the viral polymerase. This BVDV mutant was also resistant to compound 15. Molecular docking studies and MM/PBSA calculations were performed to assess the most active derivatives at the 5,6-TSC viral polymerase binding site. The differences in the interaction pattern and the binding affinity of derivative 15 either to the wild type or BVDV-TSCr T1 polymerase were key factors to define the mode of action of this compound.

Author affiliation: Soraires Santacruz, Maria Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Farmacología. Cátedra de Química Medicinal; Argentina

Author affiliation: Fabiani, Matias. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina

Author affiliation: Castro, Eliana Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina

Author affiliation: Cavallaro, Lucia Vicenta. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina

Author affiliation: Finkielsztein, Liliana Mónica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Metabolismo del Fármaco; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Departamento de Farmacología. Cátedra de Química Medicinal; Argentina