Abstract:

Author affiliation: Mazzucco, María B. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina

Author affiliation: Talarico, Laura B. Fundacion Para la Invest.en Infectologia Infantil; Argentina.

Author affiliation: Talarico, Laura B. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Virología; Argentina

Author affiliation: Carro, Ana C. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Virología; Argentina.

Author affiliation: Carro, Ana C. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria; Argentina

Author affiliation: Carro, Ana C. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Author affiliation: Fascio, Mirta L. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria; Argentina

Author affiliation: Fascio, Mirta L. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Author affiliation: D'Accorso, Norma B. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Orgánica; Argentina.

Author affiliation: D'Accorso, Norma B. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria; Argentina

Author affiliation: D'Accorso, Norma B. Centro de Investigaciones en Hidratos de Carbono; Argentina

Author affiliation: Garcia, Cybele. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Virología; Argentina.

Author affiliation: Garcia, Cybele. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria; Argentina

Author affiliation: Garcia, Cybele. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Author affiliation: Damonte, Elsa B. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica. Laboratorio de Virología; Argentina.

Author affiliation: Damonte, Elsa B. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria; Argentina

Author affiliation: Damonte, Elsa B. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Dengue virus (DENV), a member of the family Flaviviridae, is at present the most widespread causative agent of a human viral disease transmitted by mosquitoes. Despite the increasing incidence of this pathogen, there are no antiviral drugs or vaccines currently available for treatment or prevention. In a previous screening assay, we identified a group of N-allyl acridones as effective virus inhibitors. Here, the antiviral activity and mode of action targeted to viral RNA replication of one of the most active DENV-2 inhibitors was further characterized.Results: The compound 10-allyl-7-chloro-9(10H)-acridone, designated 3b, was active to inhibit the in vitro infection of Vero cells with the four DENV serotypes, with effective concentration 50% (EC50) values in the range 12.5-27.1 μM, as determined by virus yield inhibition assays. The compound was also effective in human HeLa cells. No cytotoxicity was detected at 3b concentrations up to 1000 μM. Mechanistic studies demonstrated that virus entry into the host cell was not affected, whereas viral RNA synthesis was strongly inhibited, as quantified by real time RT-PCR. The addition of exogenous guanosine together with 3b rescued only partially the infectivity of DENV-2.Conclusions: The acridone derivative 3b selectively inhibits the infection of Vero cells with the four DENV serotypes without a direct interaction with the host cell or the virion but interfering specifically with the intracellular virus multiplication. The mode of antiviral action for this acridone apparently involves the cellular enzyme inosine-monophospahe dehydrogenase together with another still unidentified target related to DENV RNA synthesis.

Abstract:

En los últimos años, se ha puesto especial énfasis en el estudio de la respuesta T CD8+ dado el rol central que esta juega en el control de la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV, human immunodeficiency virus). Sin embargo sigue siendo clave la identificación y compresión de nuevos correlatos inmune de protección. Más aún, la etapa de infección aguda representa un escenario propicio para el estudio de las funciones que mejor se correlacionan con control viral. El objetivo de esta tesis fue analizar la especificidad, funcionalidad y el fenotipo de la respuesta T CD8+ HIV-específica en una cohorte de individuos recientemente infectados y su asociación con el control de la replicación viral y de la progresión a la enfermedad (evaluado mediante la carga viral, recuento de células T CD4+ y activación inmune), durante la seroconversión y el primer año de infección. Se obtuvieron muestras de sangre de 51 individuos reclutados dentro de los primeros 6 meses desde la fecha probable de infección (PHI, Primary HIV infection); 22 sujetos crónicamente infectados (Crónicos) y 14 sujetos controladores elite (EC, Elite Controllers). Se observó que, a pesar que Nef dominó la respuesta anti-HIV durante la infección aguda/temprana, la aparición temprana de una alta proporción de células T anti- Gag se correlacionó con un retraso en la progresión. Las células T CD8+ HIV-específicas polifuncionales fueron detectadas en tiempos tempranos post-infección pero no se asociaron con control viral. Por el contrario, se observó que los sujetos PHI que presentaban células T CD8+ con una mayor capacidad de mediar actividad antiviral (VIA, viral inhibitory activity), en la muestra basal, presentaron set points inmunes más elevados. Además, los niveles de VIA se correlacionaron con la magnitud de la respuesta T CD8+ anti-Gag. A su vez, las células T CD8+ Gag-específicas mostraron una mayor capacidad de mediar la lisis de células infectadas (lo cual se evidenció por una mayor capacidad de degranulación) y de producir, de manera simultánea, INF-γ lo cual les conferiría una ventaja para ejercer su actividad antiviral. Por otro lado, se observó que la distribución de las subpoblaciones de memoria de las células T CD8+, tanto totales como de las HIV-específicas, se encuentra sesgada en los individuos PHI, pero no alcanza los niveles dramáticos observados en los sujetos Crónicos. El análisis de la expresión de PD-1 en los individuos PHI, tanto en las células T CD8+ totales como HIV-específicas, reveló no sólo una asociación con progresión a la enfermedad si no también con el perfil de memoria de la población celular T CD8+. Notablemente, se obtuvieron correlaciones directas entre los niveles de VIA y la proporción de células T CD8+ con fenotipo terminal, tanto en la muestra basal como a los 12 meses post-infección. En consecuencia, se estableció una relación entre la preservación de la ruta de diferenciación de las células T CD8+ y la funcionalidad de las mismas. Esta tesis representa el primer trabajo donde se realizó una caracterización completa de la respuesta T CD8+ en una cohorte Argentina de individuos cursando la infección aguda/temprana por HIV. El poder descifrar la relación que existe entre la características que definen a las células T CD8+ con los niveles de activación inmune, el control viral y la progresión a la enfermedad en los distintos estadíos de la infección (como son la infección primaria, crónica o en EC), como ha sido llevado a cabo en esta tesis, es primordial para profundizar en el conocimiento que se tiene de la inmunopatogénesis del virus. Además, esta información es de suma importancia para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas frente al HIV así como en el diseño y posterior testeo de vacunas que promuevan una respuesta beneficiosa.

Given the central role that HIV-specific CD8+ T-cells play in the control of the human immunodeficiency virus (HIV) replication, special emphasis has been focused on this cell population. However, correlates of immune protection remain elusive. Moreover, the acute phase of infection represents a proper scenario to delineate the antiviral cellular functions that best correlate with virus control. The aim of the present study was to analyze specificity, functionality and phenotype of the HIV-specific immune response in a cohort of acute/early HIV-infected individuals and their associations with viral control and disease progression, during the seroconvertion and the first year post-infection. Blood samples from 51 subjects recruited within 6 months from infection (primary HIV infection [PHI]); 22 chronically infected subjects (Chronics) and 14 Elite Controllers (EC) were obtained. Results indicated that, although Nef dominated the anti-HIV response during acute/early infection, a higher proportion of early anti-Gag T cells correlated with delayed progression. Polyfunctional HIV-specific CD8+ T cells were detected at early time points but did not associate with virus control. Conversely, higher CD4+ T-cell set points were observed in PHI subjects with higher capacity of the CD8+ T-cells to mediate ex vivo viral inhibitory activity (VIA), at baseline. Importantly, VIA levels correlated with the magnitude of the anti-Gag cellular response. The advantage of Gag-specific cells relied on their enhanced ability to mediate lysis of infected cells (evidenced by a higher capacity to degranulate) and to simultaneously produce IFN-γ. Moreover, it was found that normal maturation of total and HIV-specific CD8+ T-cells into memory subsets is skewed in PHI, but not at the dramatic level observed in Chronics. Analysis of PD-1 expression, on bulk and HIV-specific CD8+ Tcells, from PHI subjects revealed not only an association with disease progression but also with skewed memory CD8+ T-cell differentiation. Most notably, significant direct correlations were obtained between the VIA levels and the higher proportions of fully-differentiated HIVspecific CD8+ T cells, both at baseline and at 12 months post-infection. Thus, a relationship between preservation of CD8+ T-cell differentiation pathway and cell functionality was established. This thesis represents the first work were a fully characterization of the CD8+ T-cell response have been performed in a cohort of acute/early HIV-infected individuals from Argentina. Unscrambling relationships among the CD8+ T-cell characteristics, immune activation, viral control, and disease progression in multiple settings (primary infection, viremic Chronics and ECs), such as those observed in this work, are increasingly important to advance our understanding of HIV pathogenesis. As well, this information will be instrumental for therapeutic and sterilizing vaccine design in order to boost our ability to elicit beneficial responses.

Author affiliation: Ghiglione, Yanina Alexandra. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Tesis para obtener el grado de Doctora en Ciencias Veterinarias, de la Universidad Nacional de La Plata, en 2010

El objetivo del presente estudio fue el desarrollo y la aplicación de técnicas diagnósticas mejoradas para aumentar la eficiencia del diagnóstico del aborto bovino. Para ello, se realizó la necropsia de 150 fetos bovinos, provenientes de casos espontáneos de abortos de rodeos para producción de carne y leche. Los fetos fueron remitidos para diagnóstico por veterinarios rurales y de laboratorios de diagnóstico veterinario privados durante los años 2004,2005 y parte de 2006, y se procesaron en los laboratorios del Grupo de Sanidad Animal del INTA Balcarce. En la necropsia de los fetos se identificaron las lesiones macroscópicas; se estimó la edad fetal, el sexo y el grado de autólisis en una escala subjetiva y se recolectaron diversas muestras para análisis histopatológicos e inmunohistoquímicos, cultivo bacteriológico y aislamiento viral. Además se aplicaron técnicas serológicas para identificar anticuerpos de Neospora caninum, vDVB, HVB-1 y finalmente se aplicó la técnica de PCR para diferentes agentes infecciosos. Del total de especimenes, 104 (69,2%) provenían de rodeos para carne y 35 (23,4%) de rodeos lecheros, en 11 fetos (7,4%) no se registró el origen. Setenta y seis (50,6%) fetos fueron machos y 58 (38,6%) hembras mientras que en 16 (10,6%) oportunidades no se consignaron los datos. El 61,0% de los fetos presentó autólisis moderada (grado 2) o severa (grado 3), mientras que en el 22,0% de los casos la autólisis fetal fue leve (grado 1) y en el 24,0% restante no se registraron estos datos. Las edades de gestación de la mayoría de los fetos analizados correspondió al tercer trimestre de la gestación. El diagnóstico etiológico se determinó en 75/150 (50,0%) especímenes siendo las causas más frecuentes las de origen infeccioso (69/150, 46,0%). Las 69 causas infecciosas se diagnosticaron por cultivos microbiológicos (27 causas bacterianas: Campylobacter fetus (14 casos), Brucella abortus (6 casos), Arcanobacterium pyogenes (2 casos), Aeromona hydrophila (1 caso), Listeria monocytogenes (1 caso), Streptococcus alfa hemolítico (3 casos) y Tritrichomonas foetus (2 casos), cultivos virológicos (2 casos vDVB), IFD (11 casos Leptospira spp.), histopatología e IHQ (11 casos de N. caninum) y con el auxilio de la técnica de PCR en 15 fetos (B.abortus: 4 casos, N. caninum: 11 casos) con diagnóstico indeterminado. Por último, un caso de aborto micótico (Aspergillus fumigatus) fue diagnosticado 11 por la presencia de lesiones macroscópicas, histopatológicas y por la observación de las hifas del hongo con la tinción de Grocott. Se analizaron 110 fluidos de cavidades fetales y se obtuvieron títulos al vDVB en 15/110 (13,6%) y al HVB 14/110 (12,7%), respectivamente. La detección de anticuerpos para N. caninum por IFI se logró en 11/94 (11,7%) fluidos fetales. En 6 oportunidades (4,0%) se establecieron causas no infecciosas : malformaciones congénitas (4 casos) y de origen iatrogénico (2 casos). Los casos indeterminados fueron 75/150 (50,0%), de los cuales 39/150 (26,0%) presentaron lesiones histológicas sugestivas de origen infeccioso, mientras que en 34/150 (22,6%) no se observaron lesiones histopatológicas. Se concluye que si bien las causas infecciosas siguen siendo las principales responsables en la etiología del aborto bovino (46,0%), N. caninum fue el agente infeccioso identificado con mayor frecuencia (22/150, 14,6%). La autólisis fetal actuó en detrimento de la eficiencia y sensibilidad de la mayoría de las técnicas diagnósticas utilizadas. Con el auxilio de la técnica de PCR se pudieron identificar 15 casos que presentaban previamente diagnóstico indeterminado por los métodos convencionales, permitiendo mejorar la eficiencia diagnóstica del aborto bovino en un 10,0%.

The main objective of this study was to develope and implement improved diagnostic techniques to increase the efficiency of the diagnosis of bovine abortion. Necropsies were performed on 150 bovine foetuses, from spontaneous cases of abortions belonging to beef and dairy herds. The fetuses were referred for diagnostic from rural veterinarians and private veterinary diagnostic laboratories in the years 2004,2005 and part of 2006, and processed in the laboratories of the Animal Health Group of INTA Balcarce. In the necropsy of the foetuses the lesions were identified, foetal age, sex and degree of autolysis were estimated on a subjective scale and several samples were collected for histopathology, immunohistochemistry, bacteria culture, viral isolation, identification of antibodies against Neospora caninum, BVDV, BHV-1 through serological techniques and finally the PCR technique for different infectious agents. Foetuses belonged to beef (104, 69.2%) and dairy (35, 23.4%) herds, in 11 fetuses (7.4%) the type of herd was unknown. Seventy-six (50.6%) foetuses were male and 58 (38.6%) female while in 16 (10.6%) opportunities were not determined. 61.0% of the foetuses showed moderate (grade 2) or severe (grade 3) autolysis, while 22.0% of cases foetal autolysis was mild (grade 1) and in the remaining 24.0% these data were not recorded. The gestational ages of the most fetuses analyzed corresponded to the third trimester of the pregnancy. The etiologic cause of abortion was determined on 75/150 (50.0%) specimens and the most common causes were infectious (69/150, 46.0%). These 69 infectious cases were diagnosed by microbiological cultures (27 bacterial causes: Campylobacter fetus (14 cases) Brucella abortus (6 cases), Arcanobacterium pyogenes (2 cases), Aeromona hydrophila (1 case), Listeria monocytogenes (1case), Streptococcus alpha hemolytic (3 cases) and Trirtichomoans fetus (2 cases), virological cultures (2 cases BVDV), IFD (11 cases Leptospira spp.), histopathology and IHC (11 cases of N. caninum) and PCR in 15 fetuses (B.abortus: 4 cases, N. caninum: 11 cases) with undetermined diagnosis. Finally a mycotic abortion (Aspergillus fumigatus) was diagnosed by the presence of gross lesions, histopathology and presence of hyphae stained with Grocott. Antibodies to BVDV and HVB were found in foetal fluids in 15/110 (13.6%) and 14/110 (12.7%) specimens respectively. 13 Antibodies against N. caninum by IFA were identified in 11/94 (11.7%) foetal fluids. In 6 (4.0%) opportunities non-infectious causes were established: 4 cases of congenital malformations and 2 cases of iatrogenic origin. When a histopathological examination was performed on 75/150 (50.0%) indeterminate cases, 39 (26.0%) had histologic lesions compatible with infectious agents, while in 34 (22.6%) cases lesions were not observed. Infectious agents were the main causes in the aetiology of bovine abortion (46.0%). However, N. caninum was the most frequently agent identified (22/150, 14.6%). Foetal autolysis reduced the efficiency and sensitivity of most diagnostic techniques used. The PCR technique identified further 15 cases with indeterminate diagnosis by conventional methods, improving the diagnostic efficiency of bovine abortion by 10.0%.

EEA Balcarce

Author affiliation: Morrell, Eleonora Lidia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina

Abstract:

El virus de hepatitis C (VHC) afecta al 3% de la población mundial, representando una de las principales causas de hepatitis crónica y trasplante hepático. En el paciente infectado, el virus existe como un espectro de mutantes que difieren en su potencial de replicación, denominado cuasiespecie. La extensa variabilidad del VHC proporciona a la cuasiespecie una alta plasticidad fenotípica y capacidad de adaptación, que favorece el mantenimiento de la infección crónica. Si bien el principal sitio de replicación del VHC es el hígado, numerosos estudios han descripto la replicación del virus en tejidos extrahepáticos, en particular en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) y esto se ha asociado con el desarrollo de distintas manifestaciones extrahepáticas. Se ha relacionado a distintos genes del VHC con la compartimentación en CMSP, pero aún no está claro cuáles son los factores celulares y virales requeridos para la infección de las células linfoides, por lo que la búsqueda de patrones moleculares asociados con el linfotropismo podría aportar datos valiosos para la comprensión de este fenómeno. Además, la gran mayoría de los estudios de compartimentación se han realizado en pacientes adultos y se basan únicamente en la región HVR1 de E2. El objetivo del trabajo fue evaluar la compartimentación del VHC en CMSP y su dinámica durante la infección crónica por VHC en pacientes pediátricos mediante el análisis de genes virales involucrados en distintas etapas del ciclo de replicación viral. Se evaluó la compartimentación y la existencia de patrones moleculares asociados con el linfotropismo mediante el análisis filogenético de las secuencias de tres regiones del genoma viral: IRES, E1E2 y NS5B, obtenidas a partir de muestras seriadas de plasma y CMSP de 6 niños. Se demostró estadísticamente que existe compartimentación viral en niños, principalmente en regiones discretas dentro de E1E2 que incluyen sitios de unión a receptores, lo que sugiere que el linfotropismo del VHC podría estar determinado por restricciones en la interacción de las glucoproteínas con factores celulares involucrados en el proceso de adsorción y entrada. Si bien no se evidenció un patrón molecular asociado con el linfotropismo común a todos los casos estudiados, se observó que las regiones identificadas están sujetas a presiones selectivas diferentes en plasma y CMSP y se describieron variaciones aminoacídicas asociadas con las variantes linfotrópicas. Además de contribuir al conocimiento general acerca de la compartimentación del VHC, nuestro trabajo pone de manifiesto el importante papel que juegan las CMSP como reservorios de variabilidad genética y como compartimentos de replicación extrahepática, favoreciendo la persistencia y contribuyendo al mantenimiento de la cronicidad durante la infección por VHC en niños.

Worldwide prevalence of chronic hepatitis C virus (HCV) infection is estimated at 3%, representing the major cause of chronic hepatitis and liver transplantation. Within the infected patient, the virus exists as a spectrum of mutants which differ in their replication potential, termed quasispecies. The large variability of HCV quasispecies provides high phenotypic plasticity and adaptability, which favors the maintenance of chronic infection. Although the primary site of HCV replication is the liver, numerous studies have described replication in extrahepatic tissues, particularly in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and this has been associated with the development of different extrahepatic manifestations. Several viral genes have been linked to HCV PBMCs compartmentalization, but the factors required for the infection of lymphoid cells still remain unclear, and therefore the search for molecular patterns associated with lymphotropism could provide valuable data for the understanding of this phenomenon. In addition, most studies examining compartmentalization have been conducted in adult patients and are based solely on the HVR1 region of E2. The aim of this study was to assess the compartmentalization of HCV in PBMCs and its evolution dynamics during chronic HCV infection in pediatric patients by means of the analysis of certain genes involved in different stages of the viral replication cycle. Compartmentalization and the existence of molecular patterns associated with lymphotropism were evaluated by phylogenetic analysis of the sequences of three viral genes, namely IRES, E1E2 and NS5B, which were obtained from serial samples of plasma and PBMCs of 6 children. We showed that there is statistically significant compartmentalization in children, mainly in discrete regions within E1E2 that includes receptor binding sites, suggesting that HCV lymphotropism could be influenced by restrictions in the interaction of the glycoproteins with cellular factors involved in viral attachment and entry. While a common molecular pattern associated with lymphotropism was not evident in all the studied cases, it was found that the identified regions were influenced by different selective pressures both in plasma and PBMCs. Moreover, amino acid variations associated with lymphotropic variants were described. Besides contributing to general knowledge about the compartmentalization of HCV, our work highlights the important role played by PBMCs as reservoirs of genetic variability and as compartments for extrahepatic replication, favoring persistence and contributing to the maintenance of chronicity during HCV infection in children.

Author affiliation: Díaz Carrasco, Juan María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Las vacunas contra la fiebre aftosa inducen anticuerpos contra las proteínas estructurales y contra algunas proteínas no estructurales presentes en dichas preparaciones. Con el objeto de diferenciar animales infectados con el VFA de vacunados, se desarrollaron ensayos inmunológicos capaces de detectar anticuerpos contra una proteína no estructural del VFA. La proteína no estructural 3AB1 fue expresada en bacterias y en células de insecto y posteriormente utilizada para la detección de anticuerpos anti-3AB1. Los estudios realizados por ELISA y “Western blot" mostraron que sueros de bovinos infectados reaccionan con la proteína no estructural 3AB1 mientras que sueros de bovinos vacunados, sueros de bovinos sin infectar y sueros de animales infectados con diferentes virus bovinos no reconocen dicha proteína. Sin embargo, se hallaron anticuerpos contra el antígeno VIA (antígeno asociado a la infección viral), tanto en animales vacunados como en infectados. La detección de anticuerpos anti-3AB1 en sueros de animales infectados experimentalmente entre los 7 y los 560 días post-infección indica que los ensayos basados en la utilizaciónde la proteína no estructural 3AB1 pueden ser aplicados al diagnóstico de la fiebre aftosa.

Foot-and-mouth disease (FMD) vaccines induce antibodies against structural and some nonstructural proteins present in vaccine preparations. To differentiate between FMDV-infected and vaccinated animals, we developed immunochemical assays capable of detecting antibodies against a FMDV nonstructural protein. Recombinant nonstructural 3AB1 protein was expressed in E.coli and in insect cells and used to detect anti-3AB1 antibodies. ELISA and Western bIot analysis showed that sera from cattle infected with FMDV reacted with recombinant 3AB1 protein whereas sera from cattle which had been vaccinated against FMDV, mock-infected, or infected with different bovine viruses did not recognize the 3AB1 protein. In contrast, anti-virus infection associated antigen (VIAA) antibodies were present in both FMDV-infected and vaccinated animals. Detection of anti-3AB1 antibodies in sera of experimentally infected cattle obtained between 7 and 560 days postinfection indicated that immunological tests based on the detection of recombinant 3AB1 protein could be used for the diagnosis of FMDV infection.

Author affiliation: Silbertein, Erica M.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

La Tuberculosis representa el principal agente de mortalidad a nivel mundial en pacientes infectados con el HIV-1. Ambas infecciones conllevan a una desregulación de los ejes inmune y adrenal que influirán en el desarrollo de las correctas respuestas frente a los patógenos. Así, investigamos la subpoblacion de LT CD4+CD25-FoxP3+ (uTreg, LTreg “no convencionales”) en pacientes co infectados con tuberculosis activa (HIV-TB), en individuos HIV+ con TB latente (HIV-TBL), en individuos HIV+ sin TB y en dadores sanos (DS). En primer lugar se comparó la expresión de CD39, PD1, GITR y el estado de maduración (CD27/CD45RA) de las células uTreg entre los distintos grupos de estudio. Los pacientes HIV-TB mostraron menores niveles de expresión de CD39 y mayores de PD1 que los DS, así como un estado de maduración alterado con respecto a los demás grupos. Más aun, se observaron menores niveles de CD39 y mayores de PD1 en células uTreg de pacientes HIV-TB y DS, al compararse con la expresión en LT CD4+CD25+FoxP3+ (cTreg). Además la población uTreg mostro mayores frecuencias de la subpoblacionTreg EM, así como una capacidad de producción de IFN-γ incrementada respecto de cTreg, en ambos grupos e pacientes. Luego, evaluamos una cohorte de pacientes HIV-TB durante el transcurso del tratamiento anti tuberculoso (TaT), analizando parámetros endocrinos e inmunológicos. De esta forma se observaron valores disminuidos de DHEA-s al incio del TaT con respecto a las concentraciones presentadas por DS, que se normalizaron a través del tiempo. Además, esto se vio acompañado por un aumento en la frecuencia de células productoras de IFN-γ Mtb específicas, y por una disminución del número de células uTreg hasta alcanzar los valores presentes en DS. Finalmente, al analizar citoquinas asociadas a inflamación, se observaron niveles incrementados al inicio del TaT, que luego de seis meses retornaron a valores normales. Por último, se investigó la respuesta Mtb especifica de linfocitos T CD4+ de pacientes HIV-TB y DS, caracterizando la producción de IFN-γ y TNF-α, su distribución memoria/efectora, y la modulación por parte de DHEA sobre la respuesta y la maduración de LT. En principio se observó que el agregado de DHEA no logro modular la respuesta antígeno especifica ni en HIV-TB ni en DS. Por otro lado, se encontró una disminución de células Naive y un aumento de LT EM en el grupo HIV-TB. Además, al evaluar la producción de citoquinas de cada subpoblacion de memoria, los DS presentaron mayores niveles de IFN-γ/TNF-α en las LT EM, mientras en HIV-TB todas las poblaciones presentaron niveles similares de producción de dichas citoquinas. La adición de DHEA moduló la producción de citoquinas en los LT CM de DS y logró disminuir las diferencias existentes en la distribución memoria/efectora observadas en los LT CD4 Mtbespecíficos entre los HIV-TB y DS. El conjunto de resultados demuestran que la población uTreg a pesar de presentar diferencias en el fenotipo, el grado de maduración y en su capacidad de producir IFN-γ, posee una acción supresora similar a la de las células cTreg. Además, el trabajo permite evidenciar que el TaT logro normalizar parámetros endocrinos e inmunes a lo largo de 6 meses de terapia. Por último, se consiguió discriminar la producción de citoquinas Th1 para distintas subpoblaciones de Memoria en el contexto de la coinfeccion, y sugerir un rol modulador de DHEA sobre la diferenciación de las células antígeno específicas.

Tuberculosis is the most common opportunistic infection and represents the main cause of death worldwide in HIV-1 infected patients. Both infections lead to a deregulation of the immune and adrenal axes that influence the development of normal responses to pathogens, resulting in alterations of lymphocyte frequencies and in their functional capabilities. In this context, we aimed to investigate the previously described expanded subpopulation of LT CD4+CD25-FoxP3 + (uTreg) in co-infected patients with active tuberculosis (HIV-TB) and compared them with those uTregs analyzed in HIV+ individuals with latent TB (HIV- TBL), HIV+ individuals without TB (HIV) and a group of healthy donors (HD). So, first we evaluated the expression of CD39, PD1, GITR and the maturation status through CD27/CD45RA in the uTreg population along the different study groups. HIV-TB patients showed higher expression levels of CD39 and PD1 compared with HD. Moreover, we found significant differences in the maturation status of uTregs from HIV-TB when compared with the other study groups. We also compared uTreg vs. cTreg (CD4+CD25+FoxP3+) in HIV-TB patients and in HD. Besides this, the production of IFN-γ, TGF-β, IL-10 and suppressor capacity between both cell populations was assessed. Thus, we observed lower levels of CD39 and increased expression of PD1 in uTreg cells of both groups. Similar differences were found in these groups of individuals when maturation profile and cytokine production was analyzed, showing that uTreg cells had higher frequencies of Treg EM, as well as an increased capacity to produce IFN-γ than cTreg cells both in HIV-TB and HD groups. Secondly, we evaluated a cohort of HIV-TB patients during the course of the antituberculosis therapy (ATT), evaluating both endocrine and immunological markers. Thus, diminished plasma levels of DHEA-s were observed at the initiation of therapy, reaching normal levels after 6 months. Moreover, this was accompanied by an increase in the frequency of IFN-γMtb specific-producing cells, and a decrease in uTreg frequencies, which reached HD values at six months of therapy. Furthermore, when several cytokines associated with inflammation were analyzed during ATT, we observed a modulation of IL -6, IL-8, IL-7 and IL-12 levels, whose values decreased along anti TB therapy. Finally, we compared the responsiveness of Mtb specific LT CD4+ of HIV-TB and HD, analyzing the IFN-γ and TNF-α production, memory/effector distribution, and the modulation by DHEA of functionality and maturation status of CD4+ T cells.We observed that the DHEA did not modulate Mtb specific responses of CD4+ T cells in either group. On the other hand, when the memory/ effector distribution was compared between HIV-TB and HD, decreased proportions of naïve T cells and increased percentages of LTEM cells in HIV-TB group were found. In addition, cytokine production of memory subsets was assessed, therefore while the T CM subset produced a greater amount of IFN-γ/TNF-α compared with the other subsets of HD individuals, HIV-TB memory/effector subsets showed a similar production capacity. Addition of DHEA modified cytokine production only in TCM cells from HD. Interestingly, DHEA reduced the existing differences in CD4 T cells memory/effector distributions between Mtb-specific CD4+ cells from HIV-TB and HD. Together, these results uncover alterations of the immune-endocrine axes during HIVTB co infection. Our work also demonstrates that uTreg population, despite having an altered phenotype, maturation status and ability to produce IFN-γ, has a conserved suppressive capacity. Furthermore, this work demonstrates that ATT normalizes immune-endocrine parameters over 6 months of therapy. Finally, it was possible to discriminate Th1 cytokine production from different memory/effector subpopulations in the context of this coinfection, and to suggest a modulatory role for DHEA on the differentiation of Mtb-specific cells.

Author affiliation: Angerami, Matías Tomás. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Trabajo presentado en el XVII Congreso Brasilero de Yuca y II Congreso Latinoamericano y del Caribe de la Yuca, Belém, Brasil, 12 al 16 de marzo de 2018

La mandioca (Manihot esculenta Crantz) es uno de los principales cultivos para el consumo humano y animal, de gran importancia económica-social para muchos países (Carvalho et al., 2017). Al ser una especie que se multiplica comercialmente de forma vegetativa, una de sus principales limitantes es la diseminación de patógenos sistémicos, principalmente virus, a través del material de propagación. Hasta el momento se han reportado 16 virus en el cultivo de mandioca, siendo el Cassava common mosaic virus (CsCMV) uno de los más distribuidos en América Latina, y el agente causal de la enfermedad conocida como Mosaico común de la mandioca (CsCMD). El primer reporte de CsCMD se realizó en el sur de Brasil (Silberschmid, 1938; Costa, 1940) y en Argentina, recientemente ha tomado relevancia al ser confirmada su presencia en plantaciones de mandioca de las principales provincias productoras (Di Feo et al., 2015). Según Calvert y Cuervo (2002), la enfermedad tiene mayor importancia en el sur del Brasil y en Paraguay, donde se recomienda tomar alguna medida de control para reducir las pérdidas. Ambas regiones limitan con la zona productora de mandioca en Argentina, sin embargo, hasta el momento, no existen datos publicados de las consecuencias de esta enfermedad sobre el rendimiento del cultivo en el país. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la infección con CsCMV sobre los componentes del rendimiento de plantas de mandioca del cultivar CM3306-4 regeneradas “in vitro” por cultivo de meristemas apicales caulinares y cultivadas a campo en Laguna Blanca, Formosa, Argentina.

Author affiliation: Zanini, Andrea Alejandra. INTA. Instituto de Patología Vegetal; Argentina

Author affiliation: Collavino, Agostina Antonella. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Química Básica y Aplicada del Nordeste Argentino; Argentina. Universidad Nacional de Formosa. Facultad de la Producción y el Medioambiente. Instituto Universitario de Formosa; Argentina

Author affiliation: Medina, Ricardo Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Botánica del Nordeste. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Botánica del Nordeste; Argentina

Author affiliation: Mroginski, Luis Amado. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Nordeste. Instituto de Botánica del Nordeste. Universidad Nacional del Nordeste. Facultad de Ciencias Agrarias. Instituto de Botánica del Nordeste; Argentina

Author affiliation: Di Feo, Liliana del Valle. INTA. Instituto de Patología Vegetal; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Abstract:

Se realizó un estudio de aislamiento de virus (virus respiratorios sincicial, adenovirus, parainfluenza, influenza A y B) causantes de infecciones respiratorias, en muestras de pacientes menores de cinco años internados por infección respiratoria aguda baja, entre los años l995 a l999. Se pudo demostrar que alrededor del 6% de los casos son debidos al virus influenza. Para ese mismo período las curvas de mortalidad por influenza y neumonía muestran que los grupos de riesgo de la población son los menores de cuatro años y los mayores de 65, siendo muy importante la mortalidad por esta causa para los mayores de 75 años. El análisis de los datos recolectados por el SINAVE durante el período l995-1999 permitieron correlacionar los máximos de aislamientos positivos de virus influenza con los picos de morbilidad por síndrome tipo influenza notificados para toda la población. El análisis antigénico y genómico de aislamientos de virus Influenza humano provenientes de distintas localidades de la República Argentina durante el periodo l995- 2002 permitió establecer que las cepas circulantes de virus influenza A (H3N2) se relacionaron en forma cercana antigénicamente con las correspondientes cepas vacunales sólo a partir del año l999, mientras que las cepas HlNl se relacionaron con las componentes vacunales durante los años l998, 2000, 2001 y el 2002. Las cepas de influenza B no se relacionaron con las vacunales en los años l995, 2002 y lo hicieron parcialmente en el 2001. En la mayoría de los años estudiados hubo co-circulación de cepas de influenza A (HlNl), (H3N2) e influenza B. El análisis de la epidemiología del virus influenza en la Argentina permite concluir que el patrón epidemiológico es similar a lo que ocurre en el resto de los países del mundo desconociendo por el momento si nuestras aves también actúan como reservorios del virus así como el papel de los cerdos y otros mamíferos en el ciclo de vida de estos virus. Este estudio demuestra también que una situación similar ocurre en los países del Cono Sur, especialmente para la cepas de virus influenza A.

Author affiliation: Pontoriero, Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

En este trabajo evaluamos la eficiencia antibacteriana de un extracto etanólico de Rosmarinus officinalis L. que contiene altas concentraciones de polifenoles antioxidantes, en dos modelos de infección en piel de ratón: superficial y subcutáneo contra la bacteria patógena Staphylococcus aureus. Los resultados obtenidos muestran que el extracto de romero que contiene 2,3% de polifenoles bioactivos presentó una acción bacteriostática contra S. aureus sobre la piel del ratón, mientras que ensayando una doble concentración de polifenoles bioactivos (4,6%) se observó una inhibición total del crecimiento bacteriano. En los dos modelos de infección experimentados se observaron efectos similares. Los datos obtenidos también demuestran que la eficacia antibacteriana del extracto de romero es comparable con la acción del antibiótico comercial ácido fusídico. Los resultados indican que los polifenoles bioactivos del romero, dependiendo de su concentración, pueden ejercer in vivo acciones bacteriostáticas y bactericidas contra S. aureus.

In this paper we examined the antibacterial efficacy of an ethanolic extract of Rosmarinus officinalis L. containing a high amount of antioxidant polyphenols against the pathogenic bacteria Staphylococcus aureus in two skin infection models in mice, superficial and subcutaneous. Results obtained showed that the rosemary extract containing 2.3% of polyphenols had bacteriostatic activity against S. aureus on the skin infection. Using a double concentration of bioactive polyphenols in the treatment (4.6% of polyphenols), a total bacterial growth inhibition on the skin was suggested since we did not recover any bacteria viable in the skin mouse. A similar effect was observed in two skin models. Our results also showed that the antibacterial efficacy of the bioactives of rosemary is comparable with the antibiotic action of the well recognized antibiotic fusidic acid. All findings indicated that bioactive polyphenols of rosemary are able to carry out bactericide as well as bacteriostatic action against S. aureus in the skin mouse.

Author affiliation: Barni, María Verónica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina

Author affiliation: Fontanals, Adriana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina

Author affiliation: Moreno, Silvia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires. Fundación Instituto Leloir. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina

Abstract:

Staphylococcus aureus es un patógeno contagioso que produce infecciones intramamarias (IIM) en bovinos con tendencia a la cronicidad y refractariedad a la terapia antibiótica, causando elevadas pérdidas económicas. Las dificultades para controlar las IIM producidas por este organismo a partir de los métodos clásicos, ha llevado a desarrollar alternativas de control no antibiótico, incluyendo la inmunización. Este microorganismo produce polisacáridos capsulares (CP) que han sido incluidos tanto en inmunógenos experimentales como comerciales.. En este estudio se elaboró una bacterina con una cepa de referencia, productora de CP5, la que se inoculó en forma subcutánea en la tabla del cuello y área supramamaria en dos grupos de vaquillonas, dejando un grupo control sin inocular. Se evaluó la respuesta inmune humoral en suero y leche por el método de ELISA. Se determinó el promedio de los títulos de IgG total específicos obtenidos en suero de sangre y leche respectivamente, para cada grupo evaluado, observándose que en ambos casos los animales vacunados presentaron niveles de anticuerpos significativamente mayores al de los no vacunados (P<0,05). A partir del día 14 pre parto hasta el día 7 post parto las diferencias entre títulos de IgG total fueron significativas (P<0,05) entre los tres grupos, obteniéndose el mayor título en el grupo vacunado en el área supramamaria. En cuanto a los valores en leche, los niveles de IgG específicos resultaron significativamente superiores en los grupos vacunados respecto del placebo (P<0,05). No se detectaron diferencias en título de IgG total entre ambos grupos de vaquillonas vacunadas.

Staphylococcus aureus is a contagious pathogen that causes chronic intramammary infections (IMI) refractory to antibiotic therapy, leading to high economic loses. Classical mastitis control programs are based on hygiene during milking time and antibiotic therapy. Although these practices can control S. aureus IMI to some extent, alternative “non antibiotic” approaches have been proposed in an attempt to further control this disease. Attempts to control S. aureus IMI through vaccination have involved the use of different types of antigens, adjuvants and inoculation routes aiming to enhance immune responses. It has been shown that antibodies directed against CP favour opsonophagocytosis. The aim of this study was to evaluate the humoral immune response against a S. aureus bacterin of a reference CP5 type strain, using two different inoculation routes. Eighteen Holstein pregnant heifers were used. One group was vaccinated subcutaneously in the supramammary lymph node area (SLNA), a second group subcutaneously in the neck and a third group remained as a non vaccinated control. Levels of total IgG were assessed in sera and whey by an ELISA technique. Vaccinated animals showed significantly higher IgG levels than non vaccinated controls. In addition, heifers vaccinated through the SMLA route showed the highest IgG levels in sera. IgG levels in whey were higher in vaccinates than controls, although differences between inoculation routes were not detected. There was no difference in total IgG in both groups of vaccinated heifers.

INTA Rafaela