Abstract:

Buffaloes are compulsory vaccinated against foot-and-mouth disease virus (FMDV) in many countries as part of the official control programmes. Serological testing aimed to indirectly assess herd immunity is currently performed using the same Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) applied for bovine sera, assuming an agreement between the ELISA’s diagnostic results and those obtained using the virus neutralization test (VNT). Here we evaluated the accuracy of different ELISA tests to assess vaccine-induced antibodies against FMDV in buffalo’s sera classified according to their VNT titres. Currently used liquid-phase blocking ELISA yielded very low specificity, producing high titres for many samples with low VNT titres. To increase specificity, we developed an indirect ELISA using purified 140S viral particles and an avidity single-dilution ELISA, which includes a urea washing step after the incubation of the diluted serum sample, to detach weak binders. Combining these two highthroughput single-dilution tests, an excellent concordance with VNT was achieved. This is the first study analysing the diagnostic agreement of traditional and novel serological tests with VNT for the indirect assessment of antibodies against FMDV capsid proteins in buffalo serum samples.

Author affiliation: Sala, Juan Manuel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Corrientes. Estación Experimental Agropecuaria Mercedes; Argentina

Author affiliation: Trotta, Myrian Vanesa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina

Author affiliation: Mansilla, Florencia Celeste. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina

Author affiliation: Pérez Filgueira, Daniel Mariano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina

Author affiliation: Caspe, Sergio Gastón. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Corrientes. Estación Experimental Agropecuaria Mercedes; Argentina

Author affiliation: Capozzo, Alejandra Victoria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina

Abstract:

Molecular, antigenic and vaccine matching studies, including protective response in vivo,were conducted with a foot-and-mouth disease type O virus isolated during the outbreak in September 2011 in San Pedro, Paraguay, country internationally recognized as free with vaccination in 1997. The phylogenetic tree derived from complete VP1 sequences as well as monoclonal antibody profiling indicated that this isolate was related to viruses responsible for previous emergencies in free areas of the Southern Cone of South America occurring sporadically between the years 2000 and 2006. Marked differences with the vaccine strain O1/Campos, including the loss of reactivity with neutralizing MAbs, were recognized. Levels of protective antibodies induced by the vaccine containing the O1/ Campos strain against the San Pedro virus and the virus responsible for the previous emergency in 2006 in the Southern Cone assessed by in vitro vaccine matching studies pointed to an insufficient protective response 30 days after vaccination (DPV), which was properly attained at 79 DPV or after revaccination. In agreement with the in vitro assessment, the in vivo challenge in the Protection against Podal Generalization test in cattle indicated appropriate protection for the San Pedro strain at 79 DPV or after revaccination. The complementary conclusions that can be derived from vaccine matching tests designed differently to fit the various objectives intended: prophylaxis, emergency vaccination or incorporation of new field strains into antigen banks, is evaluated. This is the first report of the antigenic and immunogenic characterization of the variants responsible for emergencies in the Southern Cone of South America and the putative impact of the changes on the cross protection conferred by the vaccine strain.

Author affiliation: Maradei, Eduardo. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina;

Author affiliation: Malirat, Viviana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología;

Author affiliation: Perez Beascoechea, Claudia. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina;

Author affiliation: Oviedo Benitez, Elizabeth. Servicio Nacional de Calidad y Salud Animal; Paraguay;

Author affiliation: Pedemonte, Andrea. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina;

Author affiliation: Seki, Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología;

Author affiliation: Galdo Novo, Sabrina. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina;

Author affiliation: Balette, Cristina. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina;

Author affiliation: D'aloia, Ricardo. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina;

Author affiliation: la Torre, Jose Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología;

Author affiliation: Mattion, Nora Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología;

Author affiliation: Rodriguez Toledo, Jorge. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina;

Author affiliation: Bergmann, Ingrid Evelyn. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología;

Abstract:

During the years 2009 and 2010 relevant epidemic waves of foot-and-mouth disease (FMD) serotype O occurred in Ecuador, representing a great drawback for the last stages of the ongoing eradication program in South America. This study describes the molecular and antigenic characterizations of 29 isolates collected from various regions in the country and their relationship to the vaccine strain. The phylogenetic tree derived from sequences spanning the complete VP 1 protein showed that, despite the widespread origin of the viruses, they were all related among themselves and to previous isolates occurring in 2008, with around 10% difference with the vaccine strain O1/Campos. The high level of sequence conservation among different isolates in the various regions of Ecuador pointed to a common origin, suggesting animal movements as possible sources of viral spread. Monoclonal antibody profiling grouped the isolates in two major reactivity patterns which differed from that of the vaccine strain. Both profiles showed loss of reactivity with the same four MAbs, three of them with neutralizing properties. Additional sites were lost in the profile representing most of the 2010s viral samples. Levels of protective antibodies induced by the vaccine against the field strains assessed by in vitro vaccine matching studies also pointed to an increased temporal pattern of loss of a protective response. Moreover, results obtained with in vivo challenge in the protection against podal generalization test in cattle, clearly indicated lack of appropriate protection of the Ecuadorian field strains by the vaccine virus in use, which in the case of a 2010 variant was observed even after revaccination.

Author affiliation: Maradei, Eduardo. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina

Author affiliation: Perez Beascoechea, Claudia. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina

Author affiliation: Malirat, Viviana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein". Fundación Pablo Cassará. Instituto de Ciencia y Tecnología ; Argentina

Author affiliation: Salgado, Gustavo. Instituto de Medicina e Higiene Tropical “Izquieta Perez”; Perú

Author affiliation: Seki, Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein". Fundación Pablo Cassará. Instituto de Ciencia y Tecnología ; Argentina

Author affiliation: Pedemonte, Andrea. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina

Author affiliation: Bonastre, Paula. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina

Author affiliation: D'Aloia, Ricardo. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina

Author affiliation: la Torre, Jose Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein". Fundación Pablo Cassará. Instituto de Ciencia y Tecnología ; Argentina

Author affiliation: Mattion, Nora Marta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein". Fundación Pablo Cassará. Instituto de Ciencia y Tecnología ; Argentina

Author affiliation: Rodríguez Toledo, Jorge. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina

Author affiliation: Bergmann, Ingrid Evelyn. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein". Fundación Pablo Cassará. Instituto de Ciencia y Tecnología ; Argentina

Abstract:

Recombinant FMDV empty capsids have been produced in insect cells and larvae using the baculovirus expression system, although protein yield and efficiency of capsid assembly have been highly variable. In this work, two strategies were compared for the expression of FMDV A/Arg/01 empty capsids: infection with a dual-promoter baculovirus vector coding for the capsid precursor (P12A) and the protease 3C under the control of the polyhedrin and p10 promoters, respectively (BacP12A-3C), or a single-promoter vector coding the P12A3C cassette (BacP12A3C). Expression levels and assembly into empty capsids were analyzed in insect cells and larvae. We observed that the use of the single-promoter vector allowed higher levels of expression both in insect cells and larvae. Recombinant capsid proteins produced by both vectors were recognized by monoclonal antibodies (mAbs) directed against conformational epitopes of FMDV A/Arg/01 and proved to self-assemble into empty capsids (75S) and pentamers (12S) when analyzed by sucrose gradient centrifugation.

Author affiliation: Ruiz, Vanesa. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Author affiliation: Mignaqui, Ana Clara. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Author affiliation: Nuñez, M. C.. Universidad Politécnica de Madrid; España

Author affiliation: Reytor, E. Universidad Politécnica de Madrid; España

Author affiliation: Escribano, José M.. Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria ; España

Author affiliation: Wigdorovitz, Andrés. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Abstract:

Foot-and-mouth disease is a highly contagious disease that produces severe economic losses in the livestock industry. This disease is being controlled by the use of an inactivated vaccine. However, the use of recombinant empty capsids as a subunit vaccine has been reported to be a promising candidate because it avoids the use of virus in the vaccine production. A plasmid containing the capsid precursor P12A and protease 3C sequences of foot-and-mouth disease virus (FMDV) was constructed and used to compare transient and stable expression in mammalian cells. When BHK-21 cells were transfected with the recombinant vector, protease 3C cleaved the capsid precursor P12A into the structural proteins VP0, VP1 and VP3. A sucrose gradient demonstrated that the structural proteins assembled into different subviral particles. Attempts to generate a stable cell line only allowed isolating low-level-expressing clones, probably due to the effect of protease 3C on the cells. Moreover, the recombinant protein yield achieved in transient expression assays was much higher than the one achieved in stable expression assays. Results indicate that mammalian cells are a good strategy to produce recombinant FMDV subviral particles. However, the alternative approach of transient gene expression in scalable systems should be used instead of the standard method that involves the generation of a stable cell line.

Author affiliation: Mignaqui, Ana Clara. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Author affiliation: Ruiz, Vanesa. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Author affiliation: Wigdorovitz, Andrés. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Abstract:

La fiebre aftosa es una enfermedad que provoca importantes trabas en el comercio internacional y en el desplazamiento de animales en las zonas afectadas. El agente etiológico de la enfermedad es el virus de la fiebre aftosa (VFA). El avance de la Epidemiología Molecular en los últimos años ha facilitado la caracterización de las cepas que circulan en un brote y permite la determinación del probable origen y evolución del mismo. Con el objeto de estudiar los brotes surgidos en Sudamérica y especialmente en la Argentina en los últimos 15 años, se amplificó por trascripción reversa asociada a la reacción en cadena de 1a polimerasa (RT-PCR) y se secuenció la región nucleotidica que codifica para la proteína VP1 de 94 muestras del VFA. En el período 2000-2002 se identificaron y caracterizaron las dos cepas virales responsables de los brotes de serotipo A (A Argentina 2000 y A Argentina 2001) y las dos variantes del virus responsable de los brotes de serotipo O (O Argentina 2000). Asimismo se determinó la cocirculación viral de distintas cepas del VFA para los serotipos A, O y C en el período 1990-1994. Además se establecieron las relaciones filogenéticas dentro del topotipo Europeo-Sudamericano de cada uno de los serotipos y se elaboró una clasificación interna de los topotipos. Finalmente se creó un banco de secuencias nucleotïdicas de la proteína VP1 de los aislamientos sudamericanos y se optimizó la metodología molecular a utilizar en la caracterización del VFA, en casos de emergencias sanitarias en el país.

Foot and Mouth disease causes significant loses in international trade and animal movements in affected areas. The etiologic agent of the disease is the Foot and Mouth Disease Virus (FMDV). The progress of Molecular Epidemiology on past years allowed the characterization of an outbreak and the discrimination of his origin and evolution. The nucleotide VP1 coding region of 94 samples of FMDV were amplified by reverse transcription and polimerase chain reaction (RT-PCR)and sequenced. These isolates belong to South America, but most of them were obtained from Argentina in the last 15 years. In 2000-2002 period, two strains responsible for serotype A outbreaks, have been identified (A Argentina 2001 and A Argentina 2000). Also, two variants of the virus liable to serotype O outbreaks were recognized (O Argentina 2000). Viral co circulation of different serotypes A, Oand C stains has been detected on 1990-1994 years. Moreover, phylogenetic relationships have been established inside the Europe-South American topotype of each serotype and an internal classification has been established. Finally, in case of a new outbreak of the disease, a VP1 nucleotide sequence database of South-American isolates has been built up. Also, the molecular methodology has been optimised in order to characterize the FMDV strain.

Author affiliation: König, Guido Alberto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

El virus de la Fiebre Afiosa (VFA), un Aftovirus de la familia Picornaviridae, es el agente causal de una enfermedad altamente contagiosa y de tremenda importancia económica, que afecta al ganado de pezuña hendida. La diferenciación entre animales infectados y vacunados así como la detección de animales portadores del virus o “carriers” es esencial para evaluar la efectividad de campañas de control y erradicación. La detección de anticuerpos (Ac) contra un antígeno (Ag) no estructural asociado con la replicación del virus, el Ag Asociado a la Infección Viral (Ag VIA), cuyo componente principal es la ARN polimerasa o proteína 3D, altamente conservada entre los diferentes serotipos, ha sido una herramienta útil para monitorear programas de control y erradicación, como un indicador indirecto para la evaluación de la actividad viral a nivel poblacional. Es conocido que vacunas inactivadas contra el VFA pueden inducir Ac contra el Ag VIA, si bien los niveles de estos Ac son muy bajos y su permanencia mas corta que en animales infectados. Esta respuesta transitoria y variable se atribuye a la presencia de restos de la polimerasa viral en el Ag vacunal, el cual sería antigénico y resultaría en la producción de Ac contra el Ag VIA. El método más ampliamente utilizado para medir Ac contra el Ag VIA es la Inmunodifusión en Agar Gel (IDAG). Este método es simple de realizar, pero su baja sensibilidad y el uso de un Ag parcialmente purificado derivado de cultivos infectados con el virus, llevó al desarrollo de otras metodologías. Con el objeto de sobrellevar estos inconvenientes, se desarrollaron ensayos inmunológicos capaces de detectar Ac contra proteínas no estructurales del VFA, para la identificación de animales infectados con el virus. Las proteínas no estructurales, 3D y 2C, se expresaron en Escherichia coli, como proteínas de fusión a glutation-S-transferasa (GST). Se desarrolló un método de ELISA en fase-líquida (ELISA-3D) capaz de detectar Ac específicos contra la proteína 3D o RNA polimerasa del VFA. El ELISA-3D, fue capaz de detectar Ac contra la proteína 3D en suero de bovinos luego de una infección natural o experimental, desde los 5 días postinfección (dpi) hasta los 565 dpi, mientras que sueros de bovinos provenientes de zona libre de Fiebre Aftosa, así como sueros de referencia de bovinos y porcinos infectados con diferentes virus ARN y ADN, fueron negativos, resultando en una especificidad del 100%. Los resultados de la comparación del ELISA-3D con la técnica de IDAG y con un ELISA-VIA descripto previamente (Alonso y col., 1990), los que utilizan el Ag VIA semipurificado, mostraron que el ELISA-3D es altamente sensible (95.2 %), específico (100%) y reproducíble (C.V. 2.75 %). Los ensayos en sueros de animales vacunados, mostraron una respuesta transitoria de Ac inducida por algunas vacunas. La evaluación del método de “Western blot” utilizando como Ag la proteína no estructural 2C, mostró una reacción positiva cuando se analizaron sueros de bovinos infectados, mientras que sueros de bovinos de zona libre no mostraron ninguna reactividad. El estudio de sueros de bovinos vacunados mostró 1/79 sueros con reactividad positiva para Ac contra 2C. Estos resultados indican que el método de ELISA-3D, es recomendable para ser utilizado como método complementario en estudios seroepidemiológicos para monitorear actividad viral. La respuesta de Ac contra 3D inducida por la vacunación en animales con una o dos vacunaciones es transitoria. El aumento en la frecuencia de reacciones positivas luego de la revacunación, indica que para el monitoreo de actividad viral en planes de control bajo vacunación, es necesario considerar los parámetros de reacción postvacunal contra 3D para una mejor interpretación de los resultados obtenidos por éstas técnicas. Finalmente, el uso de proteínas biosintéticas tiene ventajas en su estabilidad y pureza, evita el manejo de virus vivo y provee una fuente consistente de Ag. La detección de Ac contra otras proteínas no estructurales del VFA, como es el caso de 2C, proveería un mayor grado de confianza en la identificación de animales infectados con VFA.

Foot-and-mouth disease virus (FMDV), an Aphtovirus of the Picomaviridae family, is the causal agent of a highly contagious and economically important disease of cloven-hooved animals. Differentiation between infected and vaccinated animals and the detection of carriers animals are essential to evaluate the effectiveness of control and eradication campaigns. Detection of antibodies against a non-structural antigen associated with the replication of the virus, the virus-infection-associated (VIA) antigen, the main component of which is the viral RNA polymerase or 3D protein, highly conserved among all serotypes, has been a useful tool in monitoring control and eradication programmes, as an indirect indicator of viral activity at the population level. It is well known that inactivated vaccines against FMDV can induce antibodies against the VIA antigen, although the levels of antibodies and their persistence are lower than in infected animals. This transitory and variable response is attribuited to the presence of traces of the viral polymerase in the vaccine antigen, which could be antigenic and result in the production of antibodies against the VIA antigen. The most widely used method for measuring antibody to the VIA antigen is the Agar Gel Immunodiffusion (AGID). The method is simple to perform, but its low sensitivity and the use of partially purified antigen derived from infected cell cultures, made necesary the development of other methods. With the aim of overcome this difficulties, immunochemical assays were developed, able to detect antibodies against FIVHDV non-structural proteins for the identification of infected animals with the virus. Recombinant non-structural proteins, 3D and 2C, were expressed in Escherichia coli, as fusion proteins with glutathione-S-transferase (GST). A liquid-phase blocking sandwich ELISA assay (ELISA-3D) able to detect specific antibodies to the 3D protein or RNA polymerase of FMDV was developed. The ELISA-3D, was able to detect antibodies against the 3D protein in cattle sera after natural or experimental infection as early as 5 days postinfection (dpi) and at later stages, 565 dpi, whereas sera from naive cattle from the FMD free area as bovine and porcine reference sera raised against different RNA and DNA viruses were negative, resulting in a specificity of 100%. Comparison of the ELISA-3D with the AGID and the ELISA-VIA previously described (Alonso et al., 1990), which used the semipurified VIA antigen, shows that the ELISA-3D is highly sensitive (95.2%), specific (100%) and reproducible (C.V. 2.75%). Assays in vaccinated cattle sera, demostrated a transitory antibody response induced by some vaccines. The evaluation of the “Western blot”, using as antigen the non-structural 2C protein, shows a positive reaction with sera from infected cattle, whereas sera from naive cattle from FMDV free area did not react. One of 79 sera from vaccinated cattle shows a positive antibody reaction against 2C. The results obtained here indicate that the ELISA-3D method must be used as a complementary method for seroepidemiological studies for monitoring viral activity. Antibody response to 3D induce in vaccinated or revaccinated animals was transient. The increase in the frequency of positive reactions after revaccination, suggest that to monitor viral activity in control programmes under vaccination, it is necessary to take into account the parameters of the post-vaccination anti-3D response, to make a better evaluation of the results obtained. Finally, the use of bioengineered proteins has advantages such as stability and purity, it does not require handling infective virus and provied a consistent source of antigen. The detection of antibodies to other non-structural proteins, as 2C, provides confirmatory evidence for the identification of FMDV infected animals.

Author affiliation: O’Donnell, Vivian K.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

El presente trabajo tiene como objetivo generar un sistema para ser utilizado como herramienta en técnicas de genética reversa vinculadas al estudio del virus de la Fiebre Aftosa. Se diseñó y construyó un clon basado en una copia en ADN del genoma completo de la cepa O1/Campos, que se transcribe a partir del promotor de la polimerasa del fago T7. A pesar de detectar replicación del genoma viral por identificación de ARN de cadena negativa en las células transfectadas y en pasajes sucesivos de éstas, no se observó generación de efecto citopático en células BHK-21. Se valoró la influencia de algunos cambios en nucleótidos sobre esta incapacidad, tales como mutaciones en la secuencia amino acídica, estructura secundaria del ARN, estructura secundaria y terciaria de las proteínas involucradas, y se generaron reversiones de las mutaciones que se consideraron más importantes. Se desarrolló un sistema de cuantificación de ARN viral por RT-PCR en Tiempo Real. Por otro lado, se generaron dos replicones mediante el remplazo parcial o completo de las proteínas de la cápside viral por el gen reportero Luc, incapaz de generar virus infeccioso, de modo de poder realizar estudios en laboratorios de nivel bioseguridad menos estrictos. Este sistema puede usarse para el estudio funcional de las proteínas no estructurales del virus, así como de las regiones 5’ y 3’ no codificantes. Se detectó replicación por identificación de ARN de cadena negativa en las células transfectadas así como traducción de proteínas virales por medio de técnicas de inmunofluorescencia indirecta.

The aim of the present work was to build a reverse genetic system for the molecular study of Foot-and-mouth Disease virus (FMDV). A full-length cDNA clone based on the genomic sequence of O1/Campos strain was cloned downstream of the T7 polymerase promoter. Genomic RNA was transcribed in vitro from this clone after linearization of the plasmid cDNA. Although replication of the viral genome was confirmed through the detection of negative strand RNA in transfected cells and subsequent passages, cytopathic effect on BHK-21 cells was not observed. The influence of nucleotide changes on this phenotype, such as aminoacid changes, RNA secondary structure, protein secondary and tertiary structure, were carefully analyzed, and several reversions of mutations were carried out. A Real Time RT qPCR assay to quantify FMDV RNA was developed. In a second step of this work, two replicons derived from the full length clone were constructed by partial or complete replacement of the sequences encoding the viral capsid proteins with those of the Luc gene. These replicons have the advantage that they are unable to generate infectious virus, and therefore require less strict biosecurity conditions. This system can be used for the study of the role of FMDV nonstructural proteins and the 5’ and 3’ UTRs during viral replication. Replication of the constructs was confirmed in transfected cells through detection of negative strand RNA by RT-PCR and detection of translation of viral proteins by indirect immunofluorescence techniques.

Author affiliation: Giraldez, Adrián Nicolás. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious viral disease which affects both domestic and wild biungulate species. This acute disease, caused by the FMD virus (FMDV), usually includes an active replication phase in the respiratory tract for up to 72 h postinfection, followed by hematogenous dissemination and vesicular lesions at oral and foot epithelia. The role of the early local adaptive immunity of the host in the outcome of the infection is not well understood. Here we report the kinetics of appearance of FMDV-specific antibody-secreting cells (ASC) in lymphoid organs along the respiratory tract and the spleen in cattle infected by aerosol exposure. While no responses were observed for up to 3 days postinfection (dpi), all animals developed FMDV-ASC in all the lymphoid organs studied at 4 dpi. Tracheobronchial lymph nodes were the most reactive organs at this time, and IgM was the predominant isotype, followed by IgG1. Numbers of FMDV-ASC were further augmented at 5 and 6 dpi, with an increasing prevalence in upper respiratory organs. Systemic antibody responses were slightly delayed compared with the local reaction. Also, IgM was the dominant isotype in serum at 5 dpi, coinciding with a sharp decrease of viral RNA detection in peripheral blood. These results indicate that following aerogenous administration, cattle develop a rapid and vigorous genuine local antibody response throughout the respiratory tract. Time course and isotype profiles indicate the presence of an efficient T cell-independent antibody response which drives the IgM-mediated virus clearance in cattle infected by FMDV aerosol exposure.

Author affiliation: Pega, Juan Franco. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Author affiliation: Bucafusco, Danilo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Author affiliation: Di Giacomo, S.. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina

Author affiliation: Schammas, Juan Manuel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina

Author affiliation: Malacari, D.. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina

Author affiliation: Capozzo, Alejandra Victoria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina

Author affiliation: Arzt, J.. United States Department of Agriculture. Agricultural Research Service; Argentina

Author affiliation: Pérez Beascoeachea, C.. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina

Author affiliation: Maradei, E.. Ministerio de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimento. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria; Argentina

Author affiliation: Rodríguez, L. L.. United States Department of Agriculture. Agricultural Research Service; Argentina

Author affiliation: Borca, Manuel Victor. United States Department of Agriculture. Agricultural Research Service; Argentina

Author affiliation: Pérez Filgueira, Daniel Mariano. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Abstract:

Foot and mouth disease is an acute disease of cattle with a broad distribution around the world. Due to the fast spread of FMDV infections, control measures must be applied immediately after an outbreak, such as the use of vaccines that induce fast protection. Previously, it was shown that mice vaccinated with FMD inactivated virus (iFMDV) formulated with Montanide™ ESSAI IMS D 12802 VG PR adjuvant (802-iFMDV) were protected when they were challenged 4 and 7 days post-vaccination (dpv) with homologous virus. In this work, we describe the successful use of this formulation in cattle. In addition, adjuvant Montanide™ IMS 1313 VG NPR was also tested. 802-iFMDV vaccine was able to confer 100% protection against viral challenge at 4 and 7 dpv, while eliciting low antibody levels, at 7 dpv. 1313-iFMDV vaccine induced protection in 60% of cattle. At 4 dpv, 1313-iFMDV vaccinated animals presented increased levels of IFNγ but not of macrophages. At 4 and 7 dpv, macrophages, IFNγ, nasal IgA and IgG1 antibodies against FMDV, and opsonophagocytosis were increased in animals vaccinated with 802-iFMDV indicating that these phenomena could be involved in protection.It is the first time that total protection against FMDV at early stages post-vaccination is reported using a single dose of the formulation iFMDV plus Montanide™ ESSAI D IMS 12802 VG PR adjuvant.

Author affiliation: Quattrocchi, Valeria. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Author affiliation: Pappalardo, Juan Sebastian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina

Author affiliation: Langellotti, Cecilia Ana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Author affiliation: Smitsaart, E.. Biogénesis Bagó S.A.; Argentina

Author affiliation: Fondevila, Norberto Antonio. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina

Author affiliation: Zamorano, Patricia Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina. Universidad del Salvador; Argentina