Abstract:

Tesis (Doctor en Ciencias Agropecuarias)--UNC- Facultad de Ciencias Agropecuarias, 2013.

La salinidad del suelo es una causa importante de restricción para el uso agronómico de las tierras, debido a que reduce la productividad en la mayoría de los cultivos. Debido a que el girasol ha sido desplazado hacia suelos marginales y dado el hecho que existe una elevada correlación entre expansión foliar y rendimiento en grano en este cultivo, los objetivos del presente trabajo fueron: 1) determinar variabilidad en mecanismos de tolerancia a salinidad y 2) correlacionar cambios en la dinámica de la expansión foliar y la inclusión de Na+. Las plantas fueron cultivadas bajo condiciones controladas y regadas con solución nutritiva salinizada (-0,65 MPa). La tolerancia al estrés osmótico se determinó midiendo las tasas iniciales de elongación de plantas. Las respuestas a largo plazo fueron evaluadas midiendo variables de crecimiento. Un ranking de tolerancia a salinidad indicó el siguiente orden para las líneas: HAR2>HAR1>HA64>HAR5; y para los híbridos SMR779CL>TRTIÓN MAX>ACA885>SMR769. Los genotipos presentaron diferentes grados de acumulación de Na+, pero la tolerancia relativa a la salinidad no estuvo asociada a este atributo. La tolerancia tisular al Na+ fue mayor en HAR1 que en el resto de los genotipos. Estos resultados indican la existencia de variabilidad para los mecanismos de tolerancia a la salinidad en girasol. Esta variabilidad podría ser utilizada para incrementar la tolerancia a la salinidad en este cultivo. Por otro lado se investigó si la inclusión foliar de Na+ podría influir en los mecanismos celulares subyacentes de la expansión foliar, seleccionándose dos líneas contrastantes en inclusión foliar de Na+: HAR2 y HAR1. Se hipotetizó que las respuestas a la salinidad en los estadios tempranos de la ontogenia de la hoja podrían estar dominados por las respuestas al componente osmótico de la salinidad, y que la inclusión foliar de Na+ podría alterar esta coincidencia en respuestas a largo plazo. Los efectos de la salinidad sobre las tasas de expansión foliar y de división celular fueron estudiadas en la hoja 8. Los efectos negativos del estrés fueron más notorios antes de la emergencia de la hoja. Las tasas relativas de expansión celular se afectaron en igual magnitud en ambas líneas, mientras que las tasas relativas de división celular se afectaron más en HAR1. La disminución del índice estomático en HAR2 podría conferirle ventajas frente en salinidad.

Soil salinity is a major cause of restriction in the productive use of the land as it reduces productivity in most crops and it imposes water limitations and ionic imbalances. Because sunflower is being displaced to marginal areas, including salinized soils, and as there is a high correlation between leaf expansion and grain yield, the objectives of this thesis were to: 1) determine variability in salt tolerance mechanisms in sunflower and 2) to correlate the changes in the dynamics of leaf expansion and leaf Na +inclusion of Na +. Plants were grown under controlled conditions and irrigated with salinized (NaCl, -0.65 MPa) nutrient solution. Osmotic tolerance was assessed from the initial effects of the salt treatment on plant elongation. Long-term salinity responses were evaluated by assessing whole plant growth. A relative tolerance ranking indicated tolerance in lines was HAR2>HAR1>HA64>HAR5 and in hybrids SMR779CL>TRITÓN MAX>ACA885>SMR769. The lines and hybrids showed different degrees of Na+ accumulation but relative salt tolerance was not associated to this trait. Tissue Na+ tolerance was higher in HAR1 than in the rest. These results indicate that variability for salt tolerance mechanisms exists in sunflower. Such variability may be exploited for increasing salt tolerance in this crop. It was then enquired whether leaf Na+ inclusion would influence the cellular basis of leaf expansion. Cell division and expansion was studied in leaf 8 of two sunflower lines that differ in leaf Na+ accumulation: HAR1 and HAR2. It was proposed that responses to salinity in the early stages of the salt treatment would be dominated by responses to the osmotic component of salinity, and that ion inclusion would disrupt this coincidence in long-term responses. Negative effects of salinity were greater before leaf emergence. However, while relative cell expansion rates were affected similarly both lines, relative cell division rates decreased more in HAR1, the line that includes Na+ in leaves. In HAR2, a decrease in the stomatal index was observed, perhaps conferring advantages in the adaptation to salt stress.

Abstract:

Recent results have shown that Azospirillum-inoculated lettuce seeds yield a higher number of transplanted plants with superior traits than non-inoculated controls grown with and without saline stress. However, little available information on the possibility that Azospirillum could improve nutritional and quality market parameters on plants grown under saline conditions and extend life storage has prompted us to explore this issue. In this work, seed inoculation with Azospirillum not only promoted higher biomass but also improved lettuce quality when plants were grown under salt-stress conditions. Compared to non-inoculated controls, higher ascorbic acid content was accompanied by a lower oxidation rate in Azospirillum-inoculated plants. In addition, better overall visual quality was linked to higher chlorophyll content, hue, Chroma, L and lower browning intensity. While the beneficial effects of Azospirillum inoculation were more evident at harvest, some of these continued thereafter. Compared to non-inoculated controls, higher aerial biomass, chlorophyll and ascorbic acid content, better overall visual quality, hue, Chroma and antioxidant capacity, and a lower browning intensity were observed after storage in Azospirillum-inoculated plants grown under salt stress. These results suggest that seed inoculation with Azospirillum not only could improve freshly product quality but also extend storage life in lettuce grown under salt stress.

EEA Balcarce

Author affiliation: Fasciglione, Gabriela. INTA. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Author affiliation: Casanovas, Elda M. INTA. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina.

Author affiliation: Quillehauquy, Victoria. INTA. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina

Author affiliation: Yommi, Alejandra Karina. INTA. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina

Author affiliation: Goñi, María Gabriela. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ingenierí­a. Departamento de Ingeniería Química; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Author affiliation: Roura, Sara Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ingenierí­a. Departamento de Ingeniería Química; Argentina

Author affiliation: Barassi, Carlos Alberto. INTA. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina

Abstract:

Lactobacillus casei es una bacteria que desde larga data ha sido empleada por el hombre en procesos fermentativos para la producción de quesos y chacinados y en los últimos años ha adquirido gran relevancia por su uso como probiótico. Durante los procesos mencionados y en el tracto gastrointestinal, Lb casei es sometida a diferentes tipos de estrés, entre ellos el estrés osmótico. El objetivo de este trabajo fue estudiar las modificaciones genéticas, fisiológicas y estructurales de este microorganismo cuando es sometido a un estrés hipersalino, priorizando el estudio de las actividades relacionadas con los procesos de elaboración de alimentos. En esta tesis se demostró que además de los solutos osmocompatibles generales glicín betaína y camitina, di y tripétidos pueden aumentar la osmotolerancia de Lb casei. Además de estimular el crecimiento en un medio hiperosmótico lograron restituir el grado de superenrollamiento del ADN (recuperación del linking number) de modo análogo a la camitina. La construcción y el análisis de una mutante deficiente en el transporte de di-tripéptidos, dtpT, mostró que aquellos péptidos que no son transportados eficientemente no ejercen osmoprotección, mientras que sí lo ejercen aquellos que son transportados de manera eficiente. Así mismo, se describió la pérdida de la represión ejercida por péptidos en las actividades de PrtP y Per , dos de las enzimas principales del sistema proteolítico y principales proveedoras de péptidos en el extracelular e intracelular respectivamente. En el caso de PrtP, se pudo demostrar que el aumento de la actividad se debe a una pérdida de la represión a nivel transcripcional. La demostración de la interacción de CodY (que había sido postulado como el efector de la represión por péptidos de varios componentes del sistema proteolítico en Lactococcus lactis) de Lb casei con la región promotora de prtP apunta a que ésta proteína reguladora mediaría la pérdida de represión en medio hiperosmótico. En un medio carente de péptidos y en alta sal, en cambio, la elevada actividad de PrtP se debe a un aumento de la velocidad máxima de la enzima durante el crecimiento en alta sal y no a un aumento de la actividad transcripcional. Dado que PrtP se encuentra anclada a la pared celular, la modificación de la actividad de la enzima podría ser consecuencia de modificaciones en el entorno de la proteína. Se describió una sensibilidad diferencial a la lisis y a antibióticos que actúan a nivel de envolturas en células provenientes de un medio con alta sal. El aumento de la sensibilidad a la lisis se debe directamente a alteraciones de la pared, ya que el mismo efecto se observó al emplear paredes purificadas. El análisis de las fotografias de microscopía electrónica reveló un aumento en el tamaño de las células crecidas en alta sal y claras diferencias en la pared de la misma. De estos resultados, se desprende la posibilidad de emplear el precrecimiento en NaCl como un método para facilitar la lisis de un microorganismo que normalmente es resistente a la misma. Los resultados obtenidos en esta tesis, contribuyen al conocimiento de la fisiología de bacterias lácticas en presencia de un efector de estrés que normalmente se encuentra durante los procesos en los que estos microorganismos participan.

Since long time, Laclobacillus casei has been used for the production of Cheese and sausages. In and the last few years they acquired relevance because of its use as a probiotic. During the fermentation process and in the gastrointestinal tract, Lb casei is subjected to a wide range of stressors and particularly to osmotic stress. The aim of this work was the analysis of the genetic, physiological and structural changes in this microorganism when it grows in a hyperosmotic saline condition, mainly the study of those activities related to the process involved in food production. In this thesis, it was demonstrated that as well as generally osmocompatible solutes, camithine and glycin betaine, di and tripeptides can improve osmotolerance in Lb. casei. Besides their role in stimulation of growth in high osmolarity media, they were able to re-establish the degree of DNA supercoil (recovery of linking number) as camithine did. The construction and analysis of a mutant,dtpT, unable to transport di-tripeptides, enable to show that those inefficiently transported peptides can not exert an osmoprotective role, in distinction from those efficiently transported. The lost of the repression exerted by peptides in PrtP and Per activities, two of the key enzymes of the proteolytic system and main providers of peptides was described. The lost of repression for PrtP took place at the transcriptional level. The interaction of CodY protein of Lb casei with the promoter region of prtP gene was demonstrated, this result suggests that this regulator protein would be involved in the lost of repression by peptides in a hyperosmotic media. In a hypersaline media in the absence of peptides, the high levels of PrtP activity were essentially through an increase of apparent Vmax instead of an increment of transcriptional activity. Since PrtP is anchored to the cell wall, the enzyme activity could be related to changes in the environment of the protein. The differences in the sensitivity to lysis and antibiotics, that exert their effect on the cell envelope in cells grown in the presence of salt, were indicative of these variations. The high level of lysis of the cells grown in NaCl, was also a direct consequence of changes in the cell wall; the same effect was observed when purified cell walls were used instead of whole cells. The analysis of electronic microscopy photographs revealed and increase in the size of cells grown in high salt as well as clear differences in the cell wall. These results raises, that pregrowth in hyperosmotic media could be used as an efficient method to improve lysis of this resistant to lysis bacteria. The results of this study, increase the knowledge about lactic acid bacteria physiology in the presence of NaCl, a stress effector that is usually found in fermentative process.

Author affiliation: Piuri, Mariana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

La respuesta de las bacterias al estrés osmótico es actualmente de gran interés debido a los aspectos importantes de su aplicación. La mayoría de los estudios realizados en procariotas se han focalizado sobre la regulación genética y sobre aspectos fisiológicos de la adaptación a la alta osmolaridad. El comportamiento de las envolturas no ha sido prácticamente estudiado, sin embargo, existen diversas evidencias que sugieren que la composición de las envolturas celulares posee un rol importante durante el mecanismo de osmosensado. El objetivo de este trabajo fire el de estudiar el efecto del estrés osmótico sobre la estructura y composición bioquímica y biofisica de las membranas de Bacillus subtilis YB886 utilizando diferentes enfoques como la bioquímica, espectroscopía de fluorescencia y biología molecular. En esta tesis demostramos que se producen importantes variaciones en la composición de lípidos polares y de ácidos grasos (AG) durante la adaptación de B. subtilis. Entre los principales fosfolípidos presentes en la membrana de esta especie, se observó que cuando la bacteria es crecida en medios hipersalinos se produce una disminución en el contenido de fosfatidilglicerol de 40 a 31% y un aumento en el de cardiolipina de 24 a 46%. Además de las variaciones observadas a nivel del grupo polar de los lípidos, se determinó un cambio significativo en la composición de AG entre las diferentes condiciones de cultivo. Las células crecidas en el medio hipersalino presentan una marcada disminución en el contenido de AG saturados ramificados y un aumento en el de los saturados lineales. Asimismo, se observó un aumento en el contenido de los AG monoinsaturados, los cuales representan un 6% bajo condiciones normales de crecimiento y alcanzan un 18% en estrés osmótico. Con el objetivo de caracterizar la estructura y dinámica de la membrana, se utilizaron diferentes técnicas espectroscópicas. Se determinó que en respuesta al estrés osmótico se produce un aumento en el empaquetamiento de los lípidos de las membranas, hecho que fue evidenciado por medio de las tres sondas fluorescentes utilizadas. No obstante, esta variación no se observó en los liposomas preparados con los lípidos extraídos a partir de las células, indicando que el aumento en el empaquetamiento de los lípidos depende de la presencia de las proteínas de membrana. En este trabajo también se determinó que en las membranas de B. subtilis otras propiedades fisicas de la membrana, como la hidratación de la interfaz, cambia en fimción de la osmolaridad del medio exterior. Además, se construyeron diversas cepas mutantes para la biosíntesis de fosfolípidos. Los resultados obtenidos demostraron la importancia de los lípidos aniónicos (cardiolipina y fosfatidilglicerol específicamente) en la adaptación al estrés osmótico en esta especie. Nuestros resultados indican que la interrupción del gen cls2 provoca una deficiencia total en la síntesis de cardiolipina, sugieriendo que el producto del gen cls2 es la principal cardiolipina síntasa en esta especie. En esta tesis se demostró por primera vez los cambios biofisícos y bioquímicos que se producen en la membrana de B. subtilis en respuesta al estrés osmótico. Estos cambios serian indispensables para contrarrestar el desbalance osmótico presente entre las células y el medio externo.

Bacterial response to osmotic stress is of current and increasing interest due to the important aspects of its applications. Most of the studies on prokaryotes have centered on genetic regulation and physiological aspects of their adaptation to high osmolarity. The behavior of the envelopes has been practically unexplored; nevertheless, several evidences suggest that the cell envelope composition plays an important role during the osmosensing mechanism. The aim of the present work was to study the effect of osmotic stress on the biochemical and biophysical parameters of structure and composition of the Bacillus subtilis YB886 membrane using different approaches such as biochemistry, fluorescence spectroscopy and molecular biology. In this thesis we demonstrated that there are important variations in membrane polar lipid composition and fatty acids (FA) during osmoadaptation in B. subtilis. Among the major phospholipids present in the B. subtilis membrane, a decrease in phosphatidylglycerol content from 40 to 31%, and an increase in cardiolipin content from 24 to 46% were observed when the bacteria were grown in hypsaline medium. In addition to the variations observed at the polar group level, the FA composition, in particular, showed a significant change between different growth conditions. Bacterial growth in hypertonic medium resulted in a remarkable decrease in the branched-chain saturated FA content, and an increase in straight-chain saturated FA. There was also a significant increase of unsaturated FA, which represented 6% in normal conditions and reached 18% during osmotic stress. In order to characterize membrane structure and dynamics, different spectroscopic techniques were used. Bacteria growth in hyperosmotic media evoked an increase in the lipid packing in isolated whole membranes, fact that was evidenced by the three fluorescent probes used. However, this effect was not observed in liposomes prepared with the extracted bacterial lipids indicating that it was strongly dependent on the presence of membrane proteins. In this work we also indicate that in B. subtilis membranes, other physical properties as interface hydration change as a function of the external medium osmolarity. In addition, several mutants for phospholipids biosynthesis were constructed. We demonstrated the importance of anionic lipids (cardiolipin and phosphatidylglyerol specifically) for the adaptation of this specie to osmotic stress. Our results indicated that the interruption in gene cls2 resulted in a complete deficiency in cardiolipin synthesis, suggesting that B. subtilis cls2 gene product to be the major cardiolipin synthase. In our knowledge this is the first report about the biophysical and biochemical adaptation of the B. subtilis membranes to osmotic stress. These changes would be indispensable to counteract the osmotic imbalance between the cells and the external medium.

Author affiliation: López, Claudia S.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

En zonas áridas bajo riego, los viñedos enfrentan condiciones de déficit hídrico y salinidad. Como frecuentemente estos factores de estrés ocurren simultáneamente, es difícil evaluar la gravedad relativa de cada uno de ellos. Elobjetivo del trabajo fue comparar en forma independiente las respuestas fisiológicas y vegetativas al estrés hídrico y salino de dos portainjertos de vid injertados con Cabernet Sauvignon. Se realizó un experimento en macetas con vides injertadas con Cabernet Sauvignon sobre 1103P y 101-14Mgt. Se aplicaron tres tratamientos: estrés salino (Salino), estrés hídrico (EH) y testigo sin estrés (T). El Ψ foliar a mediodía fue -1,3 MPa en Salino y EH, y -0,9 MPa en T. Luego de 54 días, Salino afectó menos el área foliar (AF) y la longitud de brotes (LB) que EH. El AF disminuyó 53% en Salino, mientras que en EH se redujo 78% respecto de T. La LB disminuyó 68% en Salino y 83% en EH. La biomasa total no presentó diferencias entre los dos tipos de estrés, disminuyendo ambos un 52% respecto de T, pero la partición de asimilados a los distintos órganos fue distinta. Salino acumuló más biomasa en parte aérea y EH en raíz. Aunque la conductancia estomática se redujo de manera similar en ambos tratamientos de estrés (-41% respecto del T) se encontró una interacción entre tipo de estrés y portainjerto para la fotosíntesis neta. Las plantas injertadas sobre 1103P acumularon un 21% menos de Na+ que las injertadas sobre 101-14Mgt. A pesar que el comportamiento de las plantas Cabernet Sauvignon injertadas fue similar para ambos portainjertos, la mayor exclusión de 1103P lo hace más propicio ante situaciones de salinidad.

In arid regions under irrigation, vineyards often face water deficit and salinity. As these stressors often occur simultaneously, it is difficult to assess their individual relative severity. The aim of this work was to independently study the physiological responses of grapevine to salinity and water deficit, in order to understand and compare their effects. A pot trial was designed, grafting Cabernet Sauvignon onto 1103P and 101-14 Mgt. Three treatments were evaluated: saline irrigation (Salino; 80 mM ClNa and field capacity), water stress (EH; 0,4 faction of soil transpirable water and 2 mM NaCl) and a control (T; without any stress factors, field capacity and 2mM NaCl). After 54 days, Salino showed smaller effect on leaf area (AF) and shoot length than EH. AF diminished 53% for Salino, while for EH, AF was reduced in a 78% with respect to T. Shoot length diminished 68% for Salino and 83% for EH. Total biomass did not show any difference between both stresses, falling 52% for both situations. However, regarding the biomass partitioning, Salino had higher canopy dry weight while EH showed higher root dry weight. Midday leaf water potential was -1,3 MPa for Salino and EH and -0,9 MPa for T. Although stomatal conductance was similarly reduced for both stress treatments (-41% compared to T), with no differences between rootstocks; an interaction was found between the type of stress and rootstock for net photosynthesis. Finally, 1103P showed a higher Na+ exclusion power than 101-14Mgt (accumulating 21% less Na+ in the plant). Even though the behavior of the Cabernet sauvignon scion was similar for both rootstocks, the higher exclusion that 1103P showed may indicate possible better performances upon salinity.

EEA Mendoza

Author affiliation: Lucero, Claudia Cecilia. INTA. Estación Experimental Agropecuaria Mendoza; Argentina

Author affiliation: Di Filippo, Marina Laura. INTA. Estación Experimental Agropecuaria Mendoza; Argentina

Author affiliation: Vila, Hernan Felix. INTA. Estación Experimental Agropecuaria Mendoza; Argentina

Author affiliation: Venier, Matias. Universidad Nacional de Cuyo. Facultad de Ciencias Agrarias. Cátedra de Quı́mica Agrı́cola; Argentina

Abstract:

Santiago del Estero es la provincia con mayor desarrollo ganadero en el NOA. La primera revolución en la ganadería chaqueña la produjo la implantación de pastos seleccionados y la segunda fue la introducción de leguminosas (Albrecht Glatzle, 2008). Los beneficios producidos por la asociación de gramíneas y leguminosas fueron estudiados por muchos investigadores (Albrecht Glatzle, 2008; Lamela et al., 2009). En estas consociaciones pueden utilizarse leguminosas exóticas o nativas. Las especies nativas una vez establecidas, son autosustentables, lo que las convierte en una alternativa conveniente especialmente para zonas marginales a las que ha sido desplazada la ganadería.

EEA Santiago del Estero

Author affiliation: Arcos, Nicolás Santiago. Universidad Nacional de Santiago del Estero. Facultad de Agronomía y Agroindustrias; Argentina

Author affiliation: Toselli, María Eugenia. Universidad Nacional de Santiago del Estero. Facultad de Agronomía y Agroindustrias; Argentina

Author affiliation: Renolfi, Rodolfo Federico. INTA. Estación Experimental Agropecuaria Santiago del Estero; Argentina.

Abstract:

Four somaclonal mutants (S1, S4, S6 and M10) and their parental Cenchrus ciliaris L. cultivar Biloela were characterized under salinity conditions at germination and vegetative growth stages. Seeds of all somaclonal mutants had higher germination percentages than cv. Biloela seeds in the control and salt treatments. At 150 mM, germination was significantly higher in M10, S6 and S4 (72.3%, 66.3% and 61.8%, respectively) than in cv. Biloela (35.5%). Mutants grown under salinity along with cv. Biloela for 35 days had a different relative growth rate. S6 had the highest growth rate, indicating its potential tolerance to salt stress, whereas M10 was the most sensitive, with Bi, S4 and S1 being intermediate tolerant genotypes. Catalase enzyme activity (CAT) in M10 decreased in response to salt stress and was significantly associated with malondialdehide content, suggesting salt injury, whereas higher levels of CAT activity in S6 during salt stress were associated with increased salinity tolerance. The present results indicate that somaclonal variation and in vitro mutagenesis offer an effective tool for improvement of C. ciliaris because the somaclonal mutants showed differential tolerance to salt stress with respect to their parental and could be a better choice for use in a breeding program.

Instituto de Fisiología y Recursos Genéticos Vegetales

Author affiliation: Lopez Colomba, Eliana. INTA. Instituto de Fisiología y Recursos Genéticos Vegetales; Argentina

Author affiliation: Tommasino, Exequiel Arturo. INTA. Instituto de Fisiología y Recursos Genéticos Vegetales; Argentina

Author affiliation: Luna, Celina Mercedes. INTA. Instituto de Fisiología y Recursos Genéticos Vegetales; Argentina

Author affiliation: Griffa, Sabrina Mariana. INTA. Instituto de Fisiología y Recursos Genéticos Vegetales; Argentina

Author affiliation: Carloni, Edgardo José. INTA. Instituto de Fisiología y Recursos Genéticos Vegetales; Argentina

Author affiliation: Ribotta, Andrea Noemi. INTA. Instituto de Fisiología y Recursos Genéticos Vegetales; Argentina

Author affiliation: Quiroga, Mariana Paola. INTA. Instituto de Fisiología y Recursos Genéticos Vegetales; Argentina

Author affiliation: Grunberg, Karina. INTA. Instituto de Fisiología y Recursos Genéticos Vegetales; Argentina

Abstract:

El interior de las células se caracteriza por su alto contenido de macromoléculas que pueden ocupar hasta un 40% del volumen total, dependiendo del tipo celular y su estado fisiológico. Esta variable característica de los entornos biológicos se conoce como hacinamiento macromolecular. El volumen excluido por el hacinamiento genera importantes consecuencias termodinámicas y cinéticas sobre procesos biológicos como el plegado y la agregación de proteína, reacciones de asociación o disociación, entre otros, convirtiéndolo en un parámetro de gran relevancia biológica. En este trabajo se desarrollaron sensores basados en FRET que permiten detectar variaciones en el nivel hacinamiento molecular en células vivas. Su diseño se basa en una fusión de proteínas capaces de realizar transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) unidas por un segmento espaciador desestructurado y flexible, de manera que puedan adoptar conformaciones más compactas en medios hacinados. Los estudios in vitro de los sensores muestran que la eficiencia de FRET se incrementa al aumentar el nivel de hacinamiento del medio, lo que confirma que en condiciones hacinadas los sensores se compactan. Para probar su funcionamiento en células vivas, los sensores se expresaron en bacterias (E. coli BL26) a las que se les aplicó un shock osmótico exponiéndolas a medios con alta concentración de NaCl. Los resultados muestran que la eficiencia de FRET aumenta instantáneamente luego del shock, indicando que la respuesta al estrés osmótico va acompañada por un aumento en el nivel de hacinamiento celular. Además, al revertir el shock osmótico volviendo a concentraciones fisiológicas de sal, se vio que la eficiencia de FRET vuelve a bajar, comprobando que la respuesta de los sensores es modulada y reversible. En conclusión, gracias a la flexibilidad del linker los sensores se compactan para ubicarse en los espacios libres que quedan entre las moléculas presentes en medios hacinados, donde el grado de compactación aumenta al incrementarse el nivel de hacinamiento. La eficiencia de FRET de los sensores varía según el grado de compactación, permitiendo su aplicación para el estudio in vivo de cambios de hacinamiento producidos durante procesos biológicos relevantes, como la respuesta a proteínas mal plegadas y la compactación de la cromatina en los núcleos de células eucariontes.

The interior of the cells is highly crowded by macromolecules that occupy up to 40% of the total volume, depending on the cell type and its physiological state. This variable is known as macromolecular crowding. The volume excluded by crowding has important thermodynamic and kinetic consequences on biological processes like protein folding and aggregation, association or dissociation reactions. For this reason, macromolecular crowding is a biologically relevant parameter. In this work we developed a family of FRET-based biosensors that detect variations in macromolecular crowding level in living cells. Their design consists in a FRET-capable protein pair fused by a flexible linker that can adopt more compact conformations in crowded media. The in vitro experiments with pure biosensors show that FRET efficiency rises with increasing crowding level, confirming that in crowded conditions the probes condense and their degree of compaction depends on crowding level. To test their functionality in living cells, the sensors were expressed in bacteria (E. coli BL26). Upon an osmotic stress with NaCl the FRET efficiency instantaneously rises, indicating that the osmotic stress produces an increase in crowding level. Moreover, the sensor response can be modulated and is reversible, as showed by the fall of FRET efficiency after restoring the original levels of salt. In conclusion, the flexibility of the linker allows the compaction of the probes as crowding level increases, and this change can be easily detected by following FRET efficiency. This property enables their application for in vivo studies of crowding changes during relevant biological processes, like the misfolded protein response or the chromatin compaction in eukaryotic cells.

Author affiliation: Labanda, María Soledad. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Se estudiaron aspectos del catabolismo de productos nitrogenados en anuros de diferentes especies, en distintos momentos de su ciclo de vida, en condiciones fisiológicas y de estrés ambiental. Se evaluaron los productos de excreción nitrogenada urinaria (amoníaco, urea y ácido úrico), la urea en plasma y la actividad específica de la arginasa y la uricasa. Se obtuvo el perfil de los productos de excreción nitrogenada urinaria de adultos Bufo arenarum, Leptodactylus ocellatus, Bufo granulosus, y Bufo chilensis de habitat terrestre, semiacuático, cavícola y montañoso respectivamente. La urea fue el componente mayoritario en la orina de todas las especies y se hallaron pequeñas cantidades de ácido úrico en las tres primeras. Se estudió el efecto de la dieta y el ayuno sobre el metabolismo de sustancias nitrogenadas para lo cual se dosó la actividad de la arginasa hepática, los productos de excreción nitrogenada urinaria y la urea en plasma en adultos de Bufo arenarum sometidos al consumo de diferentes cantidades de proteína. El ayuno redujo significativamente la actividad específica de la arginasa y aumentó el contenido total de proteínas hepáticas. La partición de los productos excretados resultó independiente de la ingesta de proteínas. Se realizó un seguimiento de la actividad de la arginasa en homogenatos totales de embriones a lo largo de 17 estadíos y el primer estadío larval de Bufo arenarum incubados en solución de Holtfreter diluída. La enzima fue detectada a partir del estadío de tubo neural y se observó un pequeño incremento en los estadios tempranos, el cual se tornó más pronunciado en la fase embrionaria final. La actividad se duplicó en el primer estadío larval coincidiendo con el momento en que los animales comienzan a alimentarse. La actividad de la arginasa hepática en larvas de Bufo arenarum de estadio 29 fue notablemente más alta que en el homogenato total de larvas de estadio 26; no obstante, la misma se mantuvo dos órdenes de magnitud por debajo de la actividad determinada en el hígado de adultos. Se evaluó la actividad de la arginasa embrionaria de Brgfoarenarum, en homogenatos totales en condiciones de estrés osmótico, desarrollando a los animales desde la fecundación en: agua destilada (simulando una sobrehidratación) y en solución de Holtfreter concentrada (simulando una ligera deshidratación) y se comparó con animales desarrollados en condiciones control (mantenidos en solución de Holtfreter). En los tres grupos la actividad creció a lo largo del tiempo. A partir del estadio de circulación branquial la actividad fue menor en el grupo de solución concentrada. En el último estadío embrionario, opérculo completo, la actividad específica de los tres grupos no presentó diferencias significativas. El estudio de la actividad de la uricasa hepática en homogenatos totales de embriones desde el estadío de opérculo completo, de larvas (estadio 29), juveniles (estadío 35) y adultos de Bufo arenarum indicó que la misma aumentó a medida que avanzó el desarrollo siendo significativa la diferencia entre el adulto y los estadios larvales. En hígado de larvas de estadío 29 mantenidas en solución de Holtfreter, agua destilada y solución de Holtfreter concentrada se encontró que la uricasa aumentó en la situación concentrada. Se comparó la actividad de la uricasa hepática de adultos de Bufo arenarum y Leptodactylus ocellatus siendo significativamente menor la de la segunda especie. Se evaluó la actividad de la arginasa en hígado de adultos de Bufo arenarum inyectados con cadmio, considerando a este metal como otro factor estresante ambiental. La misma disminuyó significativamente después de la inyección de cantidades subletales del metal. Se concluyó: l. El perfil de excreción nitrogenada no sería el mejor indicador de los ambientes que ocupan los anfibios adultos en cuanto a la disponibilidad de agua; la orina de los adultos de todas las especies estudiadas presentó cantidades medibles de ácido úrico. 2. La cantidad de proteínas ingerida por los anuros adultos modifica la actividad de la arginasa. 3. La actividad de la arginasa se detecta tempranamente en los embriones de Bufo arenarum y se incrementa a lo largo del desarrollo. 4. La arginasa embrionaria se ve reducida frente a un estrés osmótico al comienzo del desarrollo. 5. La uricasa aparece mas tardíamente en los embriones de Bufo arenarum que la arginasa y se incrementa a lo largo del desarrollo. 6. La actividad de la uricasa hepática en adultos podría ser considerada como un parámetro indicador del grado de terrestrialidad de los anuros ureotélicos. 7. En hígado de larvas la uricasa aumenta debido al estrés osmótico. 8. El cadmio inyectado a Bufo arenarum adultos provoca una reducción en la actividad de la arginasa hepática.

We studied aspects of nitrogen catabolism of different species of anurans, in varios stages of their life cycle, under physiological and stress conditions. Urinary nitrogen waste products (urea, ammonia and uric acid), plasma urea and the specific activity of arginase and uricase were evaluated; urine of adult of all studied species contained mensurable amounts of uric acid. The nitrogen waste product profile of Bufo arenarum, Leptodactylus ocellalus, Bufo granulosus, and Bufo chilensis of terrestrial, semi-aquatic, fossorial, and mountainous habitats respectively was obtained. Urea was the principal component in the urine of all the species, and small amounts of uric acid were found in the three first ones. The effect of diet and fasting on the nitrogen metabolism was studied. For this purpose, determinations of specific activity of hepatic arginase, urinary nitrogen excretion products and plasma urea were made in adult Bufo arenarum submitted to diets with different levels of protein. Fasting reduced arginase specific activity and increased total hepatic protein content. The distribution of excreted products proved to be independent of the ingested proteins. A screening of arginase activity in total homogenates of embryos was made along l7 stages and in the first larval stage of Bufo arenarum raised in Holtfreter solutions. The enzyme was detected from the stage of neural tube and a gradual increase in the early stages was observed, which became more pronounced at the end of embryonic development. The activity increased two fold at the beginning of larval stages when the animals start to feed. Hepatic arginase activity in Bufo arenarum tadpoles of stage 29 was remarkably higher than in total homogenates of stage 26 tadpoles; however, it remained two magnitude orders below the adult hepatic activity. Embryonic arginase activity of Bufo arenarum was evaluated in total homogenates in mild osmotic stress conditions, developing the animals from fertilization in: distilled water (simulating an overhydratation) and concentrated Holtfreter solutions (simulating slight dehydratation) and was compared with animals in control conditions (raised in Holtfreter solutions). In the three groups the activity increased with time. From the stage of gill circulation on the activity was lower in the group of concentrated solution. In the last embryonic stage, complete operculum, the specific activity of the three groups did not present significant differences. The study of hepatic uricase activity in total homogentes of embryos beginning at the stage of complete operculum, of tadpoles (stage 29), juveniles (stage 35) and adults of Bufo arenarum indicated that it was higher as the development advanced, the difference between the adults with respect to the other two stages being significant. In tadpoles of stage 29 liver mantained in Holtfreter solution, distilled water and concentrated Holtfreter solution it was found that uricase was increased in the concentrated situation. Hepatic uricase activity of adult Bufo arenarum and Leptodactylus ocellatus was compared, the one of the second species being significantly lower. Hepatic arginase activity of adult Bufo arenarum injected with cadmium was evaluated considering this metal as an anthropogenic environmental stressant. It decreased significantly after the injection of sublethal amounts of the metal. It was concluded that: 1. The nitrogen excretion profile would not be the best indicator of the environment of the adult amphibians in terms of water availability. 2. Arginase activity is modified by the amount of proteins taken by adult anuran. 3. Arginase activity is detected early in Bufo arenarum embryos and it increases along its development. 4. Osmotic stress reduced embryonic arginase activity at the beginning of the development. 5. Uricase appears later than arginase in Bufo arenarum embryos, and it increases along the development. 6. Adult hepatic uricase activity could be considered as an indicator parameter of the terretriality of ureotelic anurans. 7. Osmotic stress increased tadpole liver uricase activity. 8. Cadmium injected to adult Bufo arenarum provokes reduction in hepatic arginase activity.

Author affiliation: Rovedatti, María Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Los suelos salinos, característicos de zonas áridas, pueden afectar la germinación de las especies por presentar bajos potenciales hídricos o por toxicidad iónica. En este trabajo se determinó el efecto del estrés hídrico y salino sobre la germinación de Atriplex nummularia, una alternativa forrajera para zonas áridas. Las semillas fueron escarificadas para minimizar el efecto inhibidor de las brácteas y germinadas a 23 ºC sobre papel de germinación en soluciones con diferente potencial hídrico (-0,5, -1,0 y -1,5 MPa) de cloruro de sodio (NaCl) y polietilenglicol (PEG), utilizando agua destilada como control. El porcentaje de germinación y la velocidad de germinación fueron significativamente afectados por la concentración de la solución y el soluto utilizado. A valores de potencial osmótico más negativos el porcentaje de germinación y velocidad de germinación fueron significativamente menores. En los tres potenciales hídricos ensayados la velocidad y el porcentaje de semillas germinadas en NaCl fue significativamente menor que en PEG, siendo especialmente notoria esta diferencia a -1,0 MPa. Los datos sugieren que las semillas de A. nummularia presentan sensibilidad a la presencia de los iones Na+ y Cl- que afectan el proceso de germinación.

Saline soils, characteristic of arid zones, can affect the germination of the species due to low water potential or ion toxicity. The effect of water and saline stress on germination was evaluated in Atriplex nummularia a potential source of forage for arid zones. The seeds were scarified to reduce the inhibitory effect on germination and incubated in at 23 º C on germination paper imbibed with solutions of sodium chloride (NaCl) and polyethylen glycol (PEG) at three water potentials: -0,5; -1,0 and -1,5 MPa. The percentage germination and germination speed were significantly affected by the concentration of the solution and the solute used. While more negative osmotic potentials, the percentage of germination and germination speed were significantlylower. The seeds germinated in PEG solution have higher germination and germination speed than the seeds germinated in NaCl, specially in -1,0 MPa. The data suggest that the seeds of A. nummularia show sensitivity to the presence of Na+ and Cl- ions affecting the germination process.

Author affiliation: Ruiz, Monica Beatriz. INTA. Estación Experimental Agropecuaria San Juan; Argentina

Author affiliation: Parera, Carlos Alberto. INTA. Estación Experimental Agropecuaria San Juan; Argentina