Abstract:

La posibilidad de supervivencia de una población está dada, en parte, por la capacidad de sus individuos para detectar y responder a las situaciones de amenaza. Anteriormente, en nuestro laboratorio se comprobó que las larvas de Rhinella arenarum (Amphibia, Anura) producen una señal de alarma especie-específica que es liberada al medio cuando se produce daño tisular. Esta señal es detectada por conespecíficos desencadenando una serie de comportamientos antipredatorios. En la mayoría de las especies de anfibios, la respuesta antipredatoria más evidente consiste en una reducción en la actividad exploratoria. Sin embargo, en algunas especies las respuestas incluyen otras estrategias como: evitación de zonas, utilización de refugio, e incluso aumento en los niveles de actividad. Por otro lado, reducir la actividad se contrapone con otras actividades relacionadas con la explotación de recursos, como la búsqueda e ingesta de alimento, lo que conllevaría un alto costo para el individuo provocando menores tasas de crecimiento y/o desarrollo. En base a esto, distintos autores han propuesto la existencia de un compromiso entre la respuesta antipredatoria adoptada y otras actividades fundamentales para la supervivencia del animal. En esta tesis, se realizó una caracterización del comportamiento antipredatorio desencadenado por señales de alarma en las larvas de R. arenarum. Se demostró que este comportamiento presenta dos componentes: uno activo, dónde las larvas muestran eventos de escape y evitación de la zona donde el estímulo está presente, o es más intenso; y uno pasivo que consiste en la reducción completa de la actividad locomotora. Estos componentes se van alternando hasta que la larva logra detectar que el nivel de riesgo disminuye en intensidad, permitiendo que se retome la actividad exploratoria. Los resultados muestran la complejidad de la respuesta comportamental antipredatoria donde se tiende a maximizar el compromiso entre reducir los riesgos de predación y mantener otras actividades esenciales para la sobrevida del animal. Por otra parte, muchos autores han planteado que las condiciones en las que las larvas crecen y se desarrollan constituye un efecto modulador de las respuestas antipredatorias. En el caso de las larvas de R. arenarum, el desarrollo en condiciones de hacinamiento provoca la aparición de un comportamiento atípico como es el canibalismo. En esta tesis se demuestra que larvas criadas en estas condiciones dejan de responder con comportamientos antipredatorias ante señales asociadas a riesgo de predación. Mas aún, estas señales desencadenan comportamientos predatorios (exploración y ramoneo) en las larvas criadas en condiciones de hacinamiento. Estos cambios de comportamiento frente a la señal de alarma son reversibles, ya que luego de una semana en condiciones de no hacinamiento las larvas vuelven a responder de manera antipredatoria. En cuanto a la naturaleza de las señales de alarma en larvas de anfibios, hasta el momento es muy escasa la información con la que se dispone. En esta tesis se describen las características químicas, posible origen tisular y mecanismo de liberación de la señal de alarma en las larvas de R. arenarum. Se confirma que la/s molécula/s relacionadas con el riesgo de predación serían de origen peptídico de un tamaño cercano a 5 kDa. La liberación de esta señal se produce en forma pasiva por ruptura de las células que la contienen, probablemente durante los eventos de predación. Los resultados permiten también especular que estas señales provienen de las células “giant cells” presentes en el tegumento de las larvas de esta especie. Además se ha logrado establecer una co-ocurrencia entre la aparición de estas células durante el desarrollo ontogenético y el momento donde comienzan a sintetizarse las señales que desencadenen la respuesta comportamental antipredatoria. También se demostró una coincidencia entre la presencia de las giant cells en la epidermis de otra especie de bufonido (R. fernandezae), con la capacidad de generar respuestas antipredatorias en R. arenarum.

The possibility a population survival is given, in part, by the ability of their individuals to detect and respond to threatening situations. Previously, in our laboratory it was proved that Rhinella arenarum (Amphibia, Anura) tadpoles produce a species-specific alarm signal that is released to the environment after tissue damage. This signal is detected by conspecifics triggering antipredatory behaviours. In most amphibian species, the most evident antipredatory response consists in a reduction in the activity. However, in some species these responses include other strategies such as: area avoidance, use of refuge, and even increase in activity levels. On the other hand, reducing activity is contrasted with other activities related to the exploitation of resources, like search and food intake, which would entail a high cost for the individual, causing lower grow rates of and development. Based on this, different authors have proposed the existence of a compromise between the antipredatory response and other activities essential for the animal survival. In this thesis, it was made a characterization of the antipredatory behaviour triggered by alarm signals in the larvae of R. arenarum. It was demonstrated that this behaviour has two components: an active one, where the tadpoles show escape events and avoidance of the area where the stimulus is present, or is more intense; and a passive one that consists in a complete reduction of the activity. These components alternate until the larva manages to detect that the level of risk decreases in intensity, allowing the exploration activity to resume. These results demonstrate that the antipredatory behavioural response in anuran larvae is complex, and tends to maximize the compromise between reducing the predation risks and continue with other activities essential for the animal survival. On the other hand, many authors have suggested that the conditions in which tadpoles grow and develop can modulate the antipredatory responses. This thesis shows that tadpoles raised in overcrowding, a condition that triggers cannibalism events, the antipredatory response to the alarm signal disappears. And moreover, the same homogenates that produce an antipredatory response in control larvae, trigger predatory behaviours (exploration and browse) in larvae reared in cannibalistic conditions. This surprising behavioural change is reversible: after a week in conditions of no overcrowding, tadpoles respond to alarm signals in an antipredatory manner. Regarding the nature of alarm signals in amphibian larvae, so far, there is only one chemical characterization for a signal involved in intra-specific communication made in Lithobates clamitans. In this case, the alarm signal is a mixture of small peptides stored in vesicles of epidermal cells. In the present work I describe the chemical characteristics, tissue origin and release mechanism of the alarm signal in R. arenarum tadpoles. It is confirmed that the molecule that act as an alarm signal would be one or more peptides of a size less than 5 kDa. Its release occurs by breaking the cells that contain them, probably when the tadpole is captured by a predator. The results allow speculating that these signals come from the cells "giant cells" present in the tegument of the larvae of this species. In addition, I establish a co-occurrence between the appearance of these cells during ontogenetic development and the behavioural response that triggers them. A coincidence was also demonstrated between the presences of giant cells in the epidermis of another species of bufonido (R. fernandezae), with the capacity to generate antipredatory responses in R. arenarum.

Author affiliation: Raices, Marilina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

La mayoría de los tetrápodos poseen dos órganos quimiosensoriales nasales: el epitelio olfatorio (EO) y el órgano vomeronasal (OVN). Ambos sistemas sensoriales, olfatorio (SO) y vomeronasal (SVN), presentan diferencias morfológicas, bioquímicas y moleculares lo que indica que participan en procesos fisiológicos diferentes. Usualmente se asocia al SVN con la detección de feromonas, mientras que el SO participaría en la detección de “olores comunes” no vinculados a la comunicación intraespecífica. Sin embargo, varias evidencias contradicen esta hipótesis y actualmente no está claro cuáles serían las funciones diferenciales de ambos sistemas sensoriales, o qué tipo de estímulos son detectados en cada uno de ellos. Más aún, inclusive el propio origen de este sistema “dual” de quimiodetección, durante la evolución de los vertebrados, presenta algunas controversias. Generalmente se interpreta que el SVN apareció en tetrápodos como consecuencia de la adaptación al ambiente terrestre. Sin embargo, las evidencias moleculares y morfológicas actuales sugieren que tanto el SO como el SVN aparecieron tempranamente en la filogenia de los vertebrados, probablemente en un ancestro común acuático de los tetrápodos; aunque nada se sabe de la funcionalidad del SVN en este ambiente. En este contexto, los anfibios constituyen un grupo sumamente interesante para el estudio de los sistemas quimiosensoriales en tetrápodos ya que poseen una etapa larval acuática. Las pocas especies estudiadas hasta la actualidad sugieren que las larvas de anuros poseen tanto SO como SVN, pero nunca se ha realizado un análisis comparado abarcando un número considerable de especies. Por otra parte, los renacuajos presentan un repertorio muy variado de comportamientos mediados por detección de claves químicas, como: detección de comida, predadores, señales de alarma liberadas por coespecíficos, etc. Curiosamente, nada se sabe de la participación de los distintos sistemas quimiosensoriales en la detección de estos estímulos. En la presente tesis se analizaron larvas de catorce especies de anuros, en las cuales se demuestra que, tanto el SO como el SVN, se desarrollan tempranamente y están presentes durante toda la etapa larval. Las características morfológicas, histológicas y bioquímicas observadas en varias de estas especies, sugieren que un grado importante de maduración, se alcanza en ambos sistemas sensoriales durante la etapa larval. Las neuronas del EO y el OVN expresan marcadores específicos descriptos en neuronas quimiosensoriales de otros vertebrados. Además, sus axones proyectan a zonas específicas de telencéfalo: el bulbo olfatorio principal y accesorio, respectivamente, donde establecen conexiones sinápticas. Estas características nos hacen suponer que ambos sistemas sensoriales son funcionales en renacuajos. Finalmente, se ha caracterizado, en larvas del sapo común Rhinella arenarum, las respuestas comportamentales a dos tipos de estímulos diferentes mediados por detección de claves químicas. Por un lado, la detección de estímulos que indican la presencia de una fuente de alimento, y por otro, la detección de señales de alarma liberadas por otros renacuajos, un fenómeno de comunicación social conocido en larvas de otras especies de anuros. Ambos estímulos parecen estar mediados por el SO en R. arenarum, ya que las larvas con OVN ablacionado responden igual que los controles, mientras que si se ablaciona el EO las respuestas comportamentales a ambos estímulos desaparecen. Además, los análisis cuantitativos de activación neuronal mostraron que el número de neuronas sensoriales activadas aumenta en el EO luego de la exposición a ambos estímulos, mientras que en el OVN no varía respecto a los controles.

Most tetrapods have two nasal chemosensory organs: the olfactory epithelium (OE) and the vomeronasal organ (VNO). Both sensory systems, olfactory (OS) and vomeronasal (VNS), are morphologically, biochemically and molecularly different, indicating that they are involved in different physiological processes. The VNS is usually associated with pheromone detection, while the OS would detect “common odours”, which may not be involved in intraspecific communication. This hypothesis, however, has been contradicted by several data, and it is not clear, at this time, which would the relative functions of the OS and the VNS or what kinds of stimuli are detected by each sensory system. Moreover, even the evolutionary origin of this “dual” chemosensory system during vertebrates’ evolution is still controversial. It is generally believed that the VNS arose in tetrapods as an adaptation to terrestrial environment. However, the current molecular and morphological evidence, suggest that both OS and VNS appeared early in vertebrate evolution, probably in a common aquatic ancestor of tetrapods, but nothing is known about the functionality of VNS in aquatic environment. In this context, amphibians represent an extremely interesting group to study chemosensory systems among tetrapods, as they have an aquatic larval stage. The few species analysed to the present suggest that anuran larvae have both an OS and a VNS, but a comparative analysis involving a considerable number of species has never been carried out. By the other hand, tadpoles show a diverse repertoire of chemodetection mediated behaviors, such as food detection, predators’ recognition, alarm signals released by conspecifics, etc. Curiously, nothing is known about the involvement of the different chemosensory systems in detecting these stimuli. In this thesis, the analysis of 14 different anuran larvae species demonstrates that both, the OS and the SVN, are early developed in anurans, and both sensory system are present throughout the entire larval stage. The morphological, histological and biochemical characteristics founded in many of these species, suggest that a significant level of maturity is reached in both sensory systems during the larval stage of anurans. Chemosensory neurons of the EO and the VNO express specific markers described in chemosensory neurons of other vertebrates. Moreover, axons from olfactory and vomeronasal chemosensory neurons project to specific areas in the telencephalon: the main and accessory olfactory bulb, respectively, where they establish synaptic connections. These features led us to speculate that both sensory systems are functional in tadpoles. Finally, the behavioural responses to two different stimuli, mediated by chemical cues detection, has been characterized in larvae of the common toad Rhinella arenarum: First, the chemodetection of cues that indicate the presence of a food source. And second, the chemodetection of alarm signals released by other tadpoles, a social communication phenomenon widely known in other anuran larvae species. Both stimuli appear to be mediated by the OS in R. arenarum as larvae without VNO responded equally to the control animals, while if the EO is removed the behavioural responses to both stimuli was not observed. In addition, the quantitative analyses of activated neurons shows that the number of chemosensory neurons activated increases in the EO after exposure to both stimuli, while there is no detectable variation in the VNO compared to control animals.

Author affiliation: Jungblut, Lucas David. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.