Abstract:

El girasol es uno de los principales cultivos oleaginosos del mundo por su volumen de producción y composición en ácidos grasos insaturados. En promedio, durante los últimos cinco años, la producción mundial se ha mantenido estable concentrándose el 72% de la misma entre Argentina y la Unión Europea. A pesar de esto y debido a las condiciones de los precios internacionales y la productividad comparativa con otros cultivos, el área de producción se está desplazando a regiones más áridas a nivel mundial cobrando relevancia la incidencia de estreses abióticos como sequía, salinidad y bajas temperaturas. Pese a la importancia económica del girasol a escala mundial, el grado de avance de los conocimientos públicos sobre el genoma de girasol es limitado cuando se lo compara con cultivos como el arroz, el maíz, la soja, el tomate, el trigo, la papa, la cebada. Sin embargo, en los últimos cinco años, en paralelo al avance de este trabajo, se han iniciado distintos proyectos a nivel nacional e internacional orientados al análisis genómico de girasol con lo cual ha aumentado significativamente la disponibilidad de secuencias genómicas y de ADNc, con el consecuente impacto en el avance de las investigaciones y el conocimiento sobre esta especie. El objetivo de este trabajo es contribuir al conocimiento de las regiones codificantes del genoma de girasol a partir de una estrategia de genómica funcional que sirva como base para la caracterización transcripcional simultanea de los perfiles de expresión inducidos bajo condiciones de estrés y el desarrollo de marcadores funcionales. Para lo cual se abordo el desarrollo de un banco local de secuencias que se expresan o ESTs ("expressed sequence tags") diferenciales para distintos órganos y/o estadios de desarrollo de girasol y el desarrollo de una plataforma bioinformática para la caracterización de los perfiles transcripcionales de las mismas en respuesta a estrés abióticos. En una primera etapa se evaluaron distintas estrategias de secuenciación a pequeña y mediana escala para la identificación de genes diferencialmente expresados en girasol a partir de la generación colecciones de ADNc diferencial. La técnica utilizada se basó en la hibridación substractiva como herramienta para la identificación de genes diferencialmente expresados en un tejido definido, disminuyendo significativamente la redundancia en la secuenciación de clones que representan a genes abundantes y maximizando la detección de los transcriptos “raros” o poco abundantes. Esta estrategia posibilitó un incremento de la eficiencia de secuenciación dentro del marco de un proyecto genómico de pequeña escala que apunta a la identificación de genes de utilidad para propósitos de mejoramiento y la búsqueda de marcadores funcionales. Como resultado, se obtuvieron clonotecas diferenciales a partir de hoja, tallo, raíz y flor en dos estadios de desarrollo (R1 y R4). El uso de diferentes fuentes de ARN como objeto o “tester” y referencia o “driver” fue de utilidad para la selección y detección de transcriptos poco abundantes. La especificidad órgano- específica varió dentro de un rango de 75 a 100% de las secuencias no- redundantes (unigenes) dentro de cada clonoteca de ADNc. La clonoteca correspondiente al estadio R4 de flor fue la menos redundante con un 62% de secuencias únicas y la que aportó el número más elevado de secuencias nuevas de girasol. El análisis bioinformático se llevó a cabo mediante la instalación de un servidor local (INTA 01) conteniendo las herramientas de distribución pública para la edición, análisis y ensamblado de secuencias como Phred/Phrap, CAP3 y algoritmos de comparación de secuencias como BLAST y el desarrollo de BioPipeline® una plataforma desarrollada en entorno Windows para el análisis automatizado de secuencias utilizando los mismos programas y algoritmos mencionados anteriormente. La información de secuencias generadas fue depositada en la base dbESTs de NCBI para su distribución pública. Para el manejo local de esta información se desarrolló una base relacional de tipo ACeDB para la integración de la información generada y su anotación funcional. Sobre un total de 919 secuencias que fueron editadas y anotadas, 318 representan secuencias únicas. Las comparaciones contra bases de datos públicos arrojaron un valor del 60% de secuencias no-redundantes con similitud a secuencias conocidas. El número de genes novedosos predichos varió según la clonoteca analizadas, en un rango que va de 56% en las clonotecas de flor estadio R4 al 16% en las de flor R1. Las comparaciones con los ESTs de girasol depositados y reportados en bases de datos mostraron que 197 secuencias (59,9%) del total) representaban secuencias nuevas, sin similitud significativa con secuencias conocidas. Este enfoque fue exitoso respecto del aislamiento de un número significativo de secuencias reportadas asociadas en su función inferida (probable) a caracteres de importancia agronómica, procesos regulatorios y fisiológicos clave. En una segunda etapa se abordó la evaluación de la expresión relativa simultánea de los transcriptos correspondientes a las secuencias de la base de ESTs desarrollada bajo diferentes condiciones de estrés abiótico utilizando la tecnología de micromatrices de ADN. Se imprimieron los fragmentos representativos de los 318 unigenes anotados en las clonotecas previamente descriptas en micromatrices sobre soporte de vidrio. Se evaluaron tres muestras biológicas tanto para tratamiento de frío (estrés térmico), tratamiento de salinidad (estrés salino) y controles representados por plantas crecidas en condiciones regulares. Estos estreses fueron seleccionados considerando al girasol como una planta con grado intermedio-alto de sensibilidad a bajas temperaturas en la zona radicular, así como también particularmente susceptible al desarrollo en condiciones de alta salinidad. El análisis transcripcional permitió detectar 3 grupos de genes bien diferenciados en sus patrones de expresión. Por una parte el Grupo 2, integrado por 126 genes, no mostró variación en sus niveles medios a través de los tratamientos. En cambio, el Grupo 1 (integrado por 112 genes) evidenció sobre- expresión respecto del control cuando las plantas fueron sometidas a estrés (por frío o por salinidad). De manera análoga, 49 genes conformaron el Grupo 3, pero en este caso se observó una sub-expresión respecto del control en ambos tratamientos. Dentro del grupos 1 y 3, se detectaron perfiles de expresión diferenciales para ambos tipos de estrés, siendo la sobre expresión y/o sub expresión de los genes evaluados más pronunciada en respuesta al estrés por frío respecto al estrés por salinidad. Finalmente, surgieron 80 genes candidato en la separación de tratamientos de acuerdo a su p-valor en la prueba de comparación de medias por análisis de la varianza y su ubicación en la región periférica del plano de ordenación generado por los dos primeros ejes principales de un Análisis de Componentes Principales (ACP) de la matriz de expresión génica escalada gen a gen por la desviación estándar residual del análisis de la varianza. De estos genes, 7 fueron validados por técnicas de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Real Time PCR), habiéndose obtenido patrones transcripcionales similares con ambas estrategias de análisis La diferencia en expresión génica fue analizada en relación al origen de las secuencias en evaluación. Las secuencias provenientes de la colección de hoja mostraron en general patrones de subexpresión génica en respuesta a ambos estreses (la mayoría corresponden a genes asociados al proceso de fotosíntesis) mientras que las secuencias aisladas de colecciones de tallo o flor en estadio R4 mostraron patrones de inducción génica frente a los mismos estreses. Si se considera que los cambios transcripcionales en respuesta a frío y salinidad fueron evaluados en hoja, estos resultados confirman la eficiencia de la técnica de SSH utilizada para la generación de las colecciones de ADNc órgano específicas y explica la alta relación de transcriptos que muestra cambios en su perfil en respuesta a estreses en relación a los que no varían su nivel transcripcional en las condiciones evaluadas. Durante la segunda etapa de este trabajo se realizó un análisis de los 80 genes candidatos, detectándose 48 como sobre o sub expresados frente a uno u otro estrés, indicando la implicancia de mecanismos regulatorios comunes a ambos estreses. Asimismo 17 y 12 genes se detectaron inducidos o sub expresados específicamente frente a un estrés y no frente al otro. De acuerdo al análisis funcional comparativo estos genes estarían involucrados en mecanismos de regulación incluyendo procesos de transcripción, traducción, degradación/plegado o interacción de proteínas o asociados a mecanismos de generación y procesamiento de especies reactivas de oxigeno. De estas secuencias, 12 corresponden a secuencias con funcionalidad desconocida. Sólo 3 de las secuencias analizadas en este trabajo mostraron patrones transcripcionales opuestos incluyendo una con similitud a un transportador de lípidos. La información generada a partir de la caracterización del banco de ESTs constituye por una parte una fuente de información sobre genes candidatos involucrados en mecanismos de respuesta a estreses abióticos que pueden ser incluidos en ensayos de complementación en plantas transgénicas modelo y asimismo permite identificar secuencias nuevas no descriptas anteriormente para el desarrollo de marcadores funcionales a ser utilizados en programas de mejoramiento asistido de este cultivo

Sunflower is one of the most important oil crops worldwide regarding its production volume and composition in unsaturated fatty acids. However due to international price conditions and productivity respect to other crops, sunflower production is progressively expanding to arid regions worldwide. Consequently, abiotic stresses as drought, low temperatures and salinity arise as main constrains nowadays. Sunflower is considered a medium-high tolerant plant crop to low temperatures in the radial zone and sensitive to saline environment. Compared to other crops such as rice, maize, soybean, tomato, wheat, potato and barley genetic and genomic sunflower knowledge was limited until the onset of the present decade. However, in parallel to the advance of this thesis (last five years), different projects aimed to the genome analysis of cultivated sunflower and its related wild species, resulted in a significant increase of the number of available expressed and genome sequences in public databases. The objective of this work was to develop tools for structural and functional analysis of cultivated sunflower through the development of a model organ-specific ESTs ("expressed sequence tags") database, the creation and actualization of a bioinformatics platform to characterize transcriptional profiles of the represented genes in response to abiotic stress conditions with the aim to identify novel genes as a source of functional molecular markers associated to important traits, under the scope of an alternative, cost-effective strategy to high-throughput sequencing projects. In the first stage of this work a low scale sequencing strategy based on suppressed subtracted hybridization method was evaluated for the construction of organ- specific cDNA libraries in order to identify differentially expressed genes in sunflower Differential organ-specific ESTs were generated from leaf, stem, root and flower bud at two developmental stages (R1 and R4). Organ-specificity ranged from 75 to 100% of non-redundant sequences in the different cDNA libraries. Sequence redundancy varied according to the target and driver cDNA used for each library. The R4 flower cDNA library was the less redundant library with 62% of unique sequences. Bioinformatics analysis was achieved through the development of BioPipeline®, a bioinformatic tool for sequence quality analysis, contaminant sequence removal and sequence assembly and automatic annotation based on the utilization of free available software as Phred/Phrap, CAP3 and BLAST algorithms using a local server installed at the Institute of Biotechnology, INTA01. Processed sequences were deposited for public distribution in the dbEST database at NCBI. Biological information related to these sequences was locally stored using an ACeDB-based relational database as a laboratory information management system. Out of a total of 919 sequences that were edited and annotated, 318 were non redundant sequences. Comparison against sequences in public databases showed that 60% of non redundant sequences showed significant similarity to known sequences. The number of predicted novel genes varied among the different cDNA libraries, ranging from 56% in the R4 flower to 16 % in the R1 flower bud library. Comparison with sunflower ESTs on public databases showed that 197 of non- redundant sequences (60%) did not exhibit significant similarity to previously reported sunflower ESTs. This approach helped to successfully isolate 33 newly reported unique sequences for sunflower putatively related to responses to biotic and/or abiotic stresses. Application of suppressed subtracted hybridization technology not only enabled the cost effective isolation of differentially expressed sequences but it also allowed the identification of novel sequences in sunflower from a relative small number of analyzed sequences when compared to major sequencing projects. In a second stage, functional genomic studies were performed using microarray technology. A cDNA glass slide chip containing the 318 organ-specific unigenes was constructed in order to evaluate the expression profile under cold and salinity stress conditions. Three biological leaf samples from treated plants, exposed either to low temperatures or watered with NaCl solution, as well as control plants grew under standard condition, were evaluated by hybridization of fluorescence labeled treated and control RNA to target genes. Transcriptional analysis allowed the detection of three groups of genes well differentiated in their expression profiles during the exploratory analysis. One group composed by 126 genes did not show variation along treatments; a second group composed by 112 genes showed evidence of up-regulation under abiotic stress (cold or salinity), whereas a SUB- regulation in both treatments was observed in the 49 genes belonging to a third group. During the second phase of this analysis, 80 candidate genes were identified according to the p-value obtained by classical ANOVA and their peripheral location in the PCA analysis of the gene matrix. Seven genes were experimentally validated by quantitative real time PCR (qRT-PCR) being the transcriptional patterns derived from the two methods highly similar in all cases. Differences in genes expression were analyzed according to the differential organ-specific cDNA library from which they were isolated. While differential leaf library sequences showed the majority of genes sub-regulated (most of them corresponding to photosynthesis or general metabolism related genes), R4 flower developmental stage and stem libraries showed a larger number of up-regulated genes. Considering that transcriptional changes in response to salt and cold stresses were evaluated in leaf tissue, these results confirmed the efficiency of SSH technique in the generation of the differential organ specific libraries and explained the large transcription change / transcription unchanged ratio detected in these assays. Within the 80 candidate a large number of evaluated sequences (48) were either up-regulated or sub-regulated under both abiotic stresses, thus supporting common regulatory mechanisms and general responses to low temperature and salinity. Interestingly 17 sequences were specifically up regulated and 12 were specifically sub-regulated in one stress but not in the other. These genes are potentially involved in different regulatory mechanisms including transcription / translation / protein degradation / protein folding or correspond to genes involved in ROS production or ROS-scavenging and some of them (12) did not show similarity to reported gene products. Only three of the evaluated sequences in this work showed an inverted transcriptional pattern under cold and salinity stress, including one with similarity to a LTP transcript. The information obtained from this EST library characterization not only contributed as a major source of knowledge about candidate genes involved in the mechanisms of abiotic stress responses in sunflower that can be incorporated in future complementary gene studies in model or sunflower transgenic plants but also allows the detection of new putative functional markers as a key tool for marker assisted selection in sunflower.

Author affiliation: Fernández, Paula del Carmen. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Las especies del género Lotus (Fabaceae) se encuentran dentro de las leguminosas forrajeras más cultivadas mundialmente, luego de Medicago spp. y Trifolium spp. Su alto valor nutricional y su capacidad para adaptarse a diferentes condiciones ambientales han favorecido su utilización en sistemas ganaderos ubicados en áreas marginales para la agricultura. Sin embargo, la producción de materia seca y capacidad de rebrote de Lotus spp., al igual que lo observado en otras leguminosas forrajeras, se ven drásticamente reducidas durante las estaciones frías. Con el objetivo de estudiar el efecto del estrés por bajas temperaturas en el género Lotus, se evaluó la respuesta bioquímica, transcripcional y fisiológica de diferentes ecotipos de la especie modelo L. japonicus cultivados bajo estas condiciones de estrés. En particular, estos estudios fueron profundizados en los ecotipos MG-1 y MG-20, seleccionados por su respuesta contrastante durante la germinación en frio. Metabólicamente se observó una alteración en el contenido de poliaminas en las plantas tratadas, siendo los niveles de putrescina más elevados en el ecotipo tolerante (MG-20) en comparación con el ecotipo sensible (MG-1). Se realizaron estudios mediante el agregado exógeno de la diamina putrescina en L. japonicus MG-1, y también se evaluó la respuesta de la línea transgénica pRD29A:oatADC (acumuladora de putrescina bajo condiciones de estrés) de L. tenuis en estrés por frío. Mediante estos ensayos, si bien no se logró determinar el rol de la putrescina en los mecanismos de respuesta a las bajas temperaturas de Lotus spp., se observó que el nivel de este metabolito podría utilizarse como indicador de tolerancia bajo estas condiciones en L. japonicus. A nivel transcripcional, se clasificaron 1.077 genes diferencialmente expresados al comparar plantas cultivadas bajo condiciones óptimas con respecto a plantas tratadas. Este perfil transcriptómico permitió identificar diferentes vías metabólicas involucradas en la aclimatación al frío, que fueron evaluadas en la respuesta de los ecotipos MG-1 y MG-20 de L. japonicus. Los resultados obtenidos evidenciaron una alteración en la relación NADPH/NADP+, sugiriendo un desbalance redox inducido por el frío. A su vez, se determinóla actividad de diferentes enzimas antioxidantes, observándose contrastes entre ecotipos y tratamientos para la superóxido dismutasa, en particular, en la isoforma cloroplástica. A nivel fisiológico, el estrés por frío provocó fotoinhibición en ambos ecotipos, sin embargo las plantas MG-1 se vieron más afectadas que las MG-20. Nuestros resultados sugieren que los niveles de la proteína D2 del fotosistema II (PSII) estarían involucrados en este proceso. Por último, con el objetivo de profundizar en el estudio de la fotoinhibición en L. japonicus sometido a estrés por frío, se realizó un estudio del perfil de proteínas cloroplásticas en MG-1 y MG-20. Los cambios observados en sus abundancias relativas confirman una respuesta de aclimatación diferente entre ambos ecotipos. El presente trabajo de tesis permitió identificar distintos mecanismos implicados en la aclimatación al frío en L. japonicus, en los cuáles la respuesta de los cloroplastos se encontraría fuertemente vinculada. Nuestros resultados abren la posibilidad de futuros estudios y aplicaciones en otras especies de Lotus utilizadas actualmente como forrajes.

Lotus spp. are within the more cultivated forage legumes after Medicago spp. and Trifolium spp. Its high nutritional value and adaptability to marginal conditions have favored its use in areas of low agricultural suitability. However, the dry matter production and regrowth rate of cultivable Lotus spp. is drastically reduced during colder seasons. With the aim of studying the effect of cold stress in the Lotus genus, the biochemical, transcriptomic and physiological response was evaluated on different L. japonicus ecotypes under these conditions. In particular, these studies were deepened in the MG-1 and MG-20 ecotypes, obtained from their contrasting germination capacity at low temperatures. Alterations in the polyamines metabolism were observed in the treated plants, showing higher putrescine levels in the tolerant ecotype (MG-20) in comparison with the sensible ecotype (MG-1). Studies with exogenous putrescine aggregation in MG-1 L. japonicus ecotype, and transgenic pRD29A:oatADC L. tenuis (which accumulates putrescine under stress conditions) were done under chilling. Although it was not possible to determine a putrescine role in the cold response, data suggest that this metabolite could be used as a tolerance indicator under these constraint conditions in L. japonicus. High-throughput RNA sequencing was used to classify 1077 differentially expressed genes when comparing plants grown under optimal and cold stress conditions. Candidate metabolisms involved in the acclimation response to low temperatures were identified, which were further evaluated in the contrasting ecotypes MG-1 and MG-20. Data showed that a chilling-induced redox imbalance was suggested through NADPH/NADP+ ratio alterations. Antioxidant enzyme activities were also measured anddifferences were observed between ecotypes and treatments for superoxide dismutase, in particular the chloroplastic isoform. Stress-induced photoinhibition also differentially influenced both ecotypes, being MG-1 more affected than MG-20. Our results suggest that the D2 photosystem II (PSII) protein levels are involved in this phenomenon. Finally, in order to further understand the photoinhibitory process of L. japonicus under cold stress, a chloroplast protein profile was made in both MG-1 and MG-20 plants. The observed changes in their relative abundances confirm a different acclimation response between ecotypes. The present work allowed the identification of different mechanisms implicated in the cold acclimation of L. japonicus, in which the chloroplasts response would be strongly linked. Our results open the possibility for future studies and applications in other Lotus species used as forage.

Author affiliation: Calzadilla, Pablo Ignacio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Plasmodium falciparum es el parásito que causa la malaria más severa en humanos, enfermedad que afecta mundialmente a 200–300 millones de individuos al año. La descripción del genoma, del transcriptoma y del proteoma son un recurso importante para poder entender la función y la regulación de la expresión génica. En el caso del parásito P. falciparum, el 60% de los genes anotados siguen siendo hipotéticos, debido a la gran distancia evolutiva del parásito respecto de organismos modelo. Por otro lado, la presencia y abundancia de un ARNm no necesariamente se correlaciona con la abundancia de la proteína correspondiente y la cuantificación de estos parámetros son por lo tanto representaciones imperfectas de la regulación génica y proteómica subyacente. En esta tesis se establece la conexión entre ARNm y proteína midiendo directamente la traducción a nivel genómico usando la técnica de perfilamiento ribosomal, revelando por primera vez la dinámica de este proceso durante los estadíos intraeritrocíticos del parásito. Los resultados obtenidos demuestran que los procesos de transcripción y traducción están estrechamente acoplados, que el 11% del transcriptoma está regulado traducciónalmente y que este tipo de regulación juega un rol importante en genes con funciones de egreso e invasión del merozoito. Además, se presenta un conjunto de métodos mejorados para la manipulación genética a escala genómica de P. falciparum. Este conjunto de protocolos puede ser aplicado para la investigación y descubrimiento de la función de los genes del parásito.

Plasmodium falciparum is the causative agent of the most burdensome form of human malaria, affecting 200–300 million individuals per year worldwide. For the study of P. falciparum, the description of the genome, the transcriptome and the proteome are a tremendous resource for understanding gene function and gene expression regulation. However, 60% of the annotated genes in the genome remain hypothetical due to the evolutionary distance of this parasite to model organisms, and mRNA and protein abundance measurements remain imperfect representations of the underlying genetic and proteomic regulation, since the presence and abundance of an mRNA species does not necessarily correlate with the abundance of the corresponding protein. The work presented in this thesis bridges this disconnect by measuring whole genome translation, using the ribosome profiling technique, revealing for the first time translation dynamics throughout the asexual intraerythrocytic developmental cycle. The findings show that transcription and translation are tightly coupled in this parasite, that 11% of the transcriptome is translationally regulated and that this type of regulation plays a major role on genes related to merozoite egress and invasion. Additionally, presented here is an improved set of methods for 96-well plate-based transfection and culture that facilitate genome-scale genetic manipulation of P. falciparum. This set of protocols can be applied to investigation and discovery gene functions in this parasite.

Author affiliation: Caro, Florence. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Las pérdidas en cultivos ocasionadas por virus dependen mayormente de la severidad de los síntomas producidos. La comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la producción de síntomas es de importancia para el desarrollo de estrategias que permitan reducir las pérdidas ocasionadas por fitovirus. Mediante el uso de cepas de virus de los géneros Tobamovirus y Potyvirus, el presente trabajo analizó la relación entre la severidad de sus síntomas en Nicotiana tabacum y Arabidopsis thaliana con su capacidad para alterar diferencialmente parámetros morfológicos, fisiológicos y transcriptómicos relevantes para los procesos de desarrollo y respuestas a estrés, hormonas y defensa. Los resultados indicaron que a tiempos tempranos de la infección en tejidos sistémicos, cuando aún no son visibles los síntomas característicos de la infección, se producen cambios moleculares importantes. Éstos incluyen alteraciones en la acumulación de metabolitos vinculados con procesos de señalización y defensa, así como cambios transcriptómicos en genes clave en redes de senescencia, defensa y respuesta a hormonas. La respuesta de microRNAs con importantes roles en el desarrollo ante tratamientos con hormonas y virus exhibió un componente transcripcional y muchos de estos genes reguladores evidenciaron un patrón bifásico de cambios, sugiriendo que los procesos que conducen a su alteración en etapas tempranas de la infección difieren de los que condicionan la misma a etapas avanzadas. En Arabidopsis, gran parte de las diferencias en alteraciones fisiológicas y de síntomas inducidas por distintas cepas de un Potyvirus se perdieron en plantas mutantes para la vía del ácido salicílico. A la luz de estos hallazgos, se propone un mecanismo por el cual la retroalimentación entre ácido salicílico y especies reactivas de oxígeno determina la activación de genes clave en los procesos de desarrollo y senescencia.

Losses on crops caused by virus mostly depend on symptoms severity. The understanding of the molecular mechanisms underlying the production of symptoms is important for the development of strategies that will reduce the losses caused by plant virus. By using viral strains of virus of the genus Tobamovirus and Potyvirus, this study analyzed the relationship between the severity of their symptoms in Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana with their ability to differentially alter physiological, morphological and transcriptomic parameters relevant to the processes of development and responses to stress, hormones, and defense. The results indicated that at early times of infection in systemic tissues, when the characteristic symptoms of the infection are still not visible, important molecular changes occur. These include alterations in the accumulation of metabolites linked to processes of signaling and defense, as well as transcriptomic changes in key genes in senescence, defense and response to hormones networks. The response of microRNAs with important roles in development following treatment with hormones and viruses exhibited a transcriptional component and many of these regulatory genes showed a biphasic pattern of changes, suggesting that the processes that lead to their alteration at early stages of infection differ from which condition it to advanced stages. In Arabidopsis, much of the differences in physiological changes and symptoms induced by different strains of a Potyvirus were lost in mutant plants for salicylic acid pathway. In the light of these findings, a mechanism is proposed by which the feedback between salicylic acid and reactive oxygen species determines the activation of key gen es in the processes of development and senescence.

Author affiliation: Manacorda, Carlos Augusto. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Lotus japonicus es una legumbre modelo ampliamente utilizada para el estudio de procesos importantes como la nodulación y la respuesta al estrés salino. Sin embargo, existen pocos estudios sobre la respuesta defensiva de esta especie contra microorganismos patógenos. Comprender como se protege esta especie modelo contra patógenos podría ayudar a desarrollar cultivares más tolerantes en especies de Lotus de relevancia agronómica, así como también en otros géneros de legumbres. Para poder dilucidar los mecanismos de defensa más importantes en esta leguminosa, en este trabajo se exploraron las principales respuestas de dos ecotipos fenotípicamente contrastantes, Miyakojima MG-20 y Gifu B-129, a la inoculación con la bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. Las respuestas de defensa activadas en ambos ecotipos fueron considerablemente diferentes. Así, en Miyakojima MG-20 se observó una interacción compatible caracterizada por una rápida multiplicación de la bacteria, acompañada por un descenso en la eficiencia del fotosistema II, la aparición de clorosis, desecación y defoliación, así como un moderado pero sostenido aumento en los niveles de especies reactivas del oxígeno (EROs). Estos fenómenos sólo fueron observados en los folíolos inoculados y no afectaron el desarrollo normal de la planta. Por su parte, en Gifu B-129 la interacción fue incompatible, los síntomas fueron en general imperceptibles, la bacteria fue incapaz de multiplicarse en los tejidos de la planta y existió un aumento notable de las EROs durante las primeras horas luego de la inoculación con la bacteria. A partir de estudios transcripcionales utilizando microarreglos de ADN, pudieron identificarse alrededor de 3000 genes regulados diferencialmente frente a la inoculación con la bacteria en el ecotipo Miyakojima MG-20 y alrededor de 300 genes en el ecotipo Gifu B-129. Además, se comparó la expresión génica basal de estas líneas, observándose diferencias en genes relacionados con estrés biótico y abiótico, metabolismo hormonal, estado redox y procesos fotosintéticos. Por otro lado se realizó un estudio del metaboloma, en el cual también se observó un comportamiento contrastante entre ambos ecotipos, detectándose un conjunto diferente de metabolitos que se modifican frente a la inoculación con la bacteria. Integrando los resultados del transcriptoma y del metaboloma se pudieron identificar numerosas vías metabólicas afectadas de manera diferencial en respuesta al ataque bacteriano, lo que permite explicar las diferencias de comportamiento observadas entre ambos ecotipos. Entre estas vías se destacan el sistema de antioxidantes (ascorbato y glutatión), el metabolismo del ácido γ-aminobutírico, la síntesis y degradación de componentes de la pared celular, la síntesis y degradación lípidos y el metabolismo hormonal. Posteriormente, sobre la base del análisis transcriptómico se seleccionaron distintas líneas mutantes insercionales del ecotipo Gifu B-129 para un conjunto de genes que podrían jugar un rol importante en la defensa vegetal. La mayoría de tales líneas demostró una tolerancia equivalente a la observada en la línea salvaje, sugiriendo que los genes mutados no son esenciales en la respuesta de defensa en estos ecotipos. Sin embargo, una línea incapaz de expresar el gen de la enzima Poliamina Oxidasa I demostró una mayor tolerancia durante la patogénesis, lo que indicaría que la expresión de este gen afecta negativamente la respuesta defensiva de la planta. Este trabajo permitió describir de manera global las principales vías metabólicas reguladas en dos ecotipos de L. japonicus durante la respuesta a la bacteria P. syringae pv. tomato DC3000. Las diferencias entre las respuestas inducidas en el ecotipo Gifu B-129 (interacción incompatible) con las observadas en el ecotipo Miyakojima MG-20 (interacción compatible) permitieron discernir cuales son los mecanismos de defensa más efectivos entre los presentadaos por los ecotipos evaluados. Estos resultados podrían ser extrapolados a otras especies de leguminosas de interés agronómico.

Lotus japonicus is a model legume widely used for the study of important processes such as nodulation and response to salt stress. However, there are few works focusing on the defensive response of this species against pathogenic microorganisms. Understanding how this model species responds against plant pathogens could help to develope more tolerant cultivars in agronomically important Lotus species as well as in other legume genera. In order to elucidate the most important defensive mechanisms in this legume, in this work it was explored the main responses of two phenotypically contrasting L. japonicus ecotypes, Miyakojima MG-20 and Gifu B-129, to the inoculation with the bacterial species Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. The defensive responses activated in both ecotypes were considerably different. Thus, in Miyakojima MG-20 was observed a compatible interaction, characterized by a rapid multiplication of the bacteria in infiltrated tissues, along with a decrease in the efficiency of the photosystem II, the appearance of chlorosis, desiccation and defoliation, as well as a moderate but steady increase in the levels of reactive oxygen species (ROS). All these symptoms were observed only in the inoculated leaflets, and never affected the normal development of the plant. In contrast, the interaction was incompatible in Gifu B-129 , where symptoms were rather imperceptible, the bacterium was unable to multiply in leaf tissues, and a critical increase in ROS accumulation was observed during the first few hours after bacterial infiltration. Based on DNA microarrays, were identified about 3,000 differentially regulated genes, upon infiltration with the bacteria in Miyakojima MG-20, and about 300 genes of this type in Gifu B-129. Moreover, it was posible to compare the basal gene expression between these lines, which showed differences in genes related to biotic and abiotic stresses, hormonal metabolism, redox state, and photosynthetic processes. A metabolomic study on these samples was also performed, revealing that a different set of metabolites in each ecotype was modified in response to the bacteria. By integrating the transcriptomic and metabolomic data, several metabolic pathways affected differentially in response to bacterial attack were identified , which helps to explain the observed differences in behavior between both ecotypes. Among these pathways stand out those of the antioxidants system (ascorbate and glutathione), the γ-aminobutyric acid metabolism, the synthesis and degradation of cell wall components, the synthesis and degradation of lipids, and hormone metabolism. Finally, several insertional mutants of the Gifu B-129 ecotype were selected for a set of genes that could play an important role in plant defense. Most of them showed a level of tolerance to the bacteria similar to that of the wild type, suggesting that this genes are not essentials in the defense response in these ecotypes. However, one line defective in the Polyamine Oxidase I gene showed higher tolerance, indicating that the expression of this gene during the plant response to the bacterial attack. negatively affects the defense of the plant. This work globally describes the main metabolic pathways regulated in response to P. syringae pv. tomato DC3000 in two ecotypes of L. japonicus. The differences between the responses triggered in the ecotype Gifu B-129 (incompatible interaction) and Miyakojima MG-20 (compatible interaction) let us to unravel the most effective defense mechanisms among those presented by the evaluated ecotypes. These results could be extrapolated to other agronomical important legumes.

Author affiliation: Bordenave, César Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Los estudios de secuenciación de alto rendimiento están abriendo nuevos caminos para investigar las respuestas adaptativas que los organismos despliegan en entornos alternativos. Sin embargo, mucho queda por entender sobre las bases genéticas de la adaptación a las plantas hospedadoras. La especies cactófilas de Drosophila que se encuentran en América del Sur tienen distinto grado de divergencia y especialización en la explotación de los cactus que habitan. La utilización de tejidos necróticos como hospedadores ha ligado su historia evolutiva a la expansión, retracción y diversificación de las cactáceas durante los cambios climáticos promovidos por los periodos glaciales del cuaternario. Las especies hermanas D. buzzatii y D. koepferae divergieron hace unos cinco millones de años y actualmente muestran una marcada diferenciación en caracteres de historia de vida, morfología y hábito, que aparentemente habrían evolucionado como adaptaciones a las distintas plantas hospedadoras. En su región simpátrica, ubicada en el noroeste Argentino, utilizan alternativamente cardones (Trichocereus terscheckii) y tunas (Opuntia sulphurea) como recursos de cría, donde el hospedador primario de una resulta en el secundario de la otra. Sin embargo, el cambio de hospedador afecta seriamente los componentes del fitness cuando ambas especies son criadas en el recurso secundario, lo que sugiere un importante papel de los metabolitos secundarios en el proceso de especialización ecológica. En la presente tesis, se estudiaron las particularidades genómicas de estas especies hermanas, así como la expresión génica en diferentes aproximaciones a las condiciones naturales de cría. A partir de los resultados, se desprenden diferencias entre ambas especies, tanto en su arquitectura genética como en su modulación transcripcional. Precisamente la mayor diferencia se encontró en la modulación transcripcional que llevan a cabo en los diferentes recursos de cría, aunque en ambos casos los genes diferencialmente expresados estuvieron principalmente relacionados con detoxificación, óxido-reducción y respuesta a estrés, pero también con desarrollo y procesos neurobiológicos. Esta trabajo aporta nuevos datos sobre el rol de la plasticidad transcripcional y las bases genómicas de estrategias adaptativas a ambientes de cría alternativos.

High-throughput sequencing studies are breaking new ground to investigate the adaptative responses that organisms deploy in alternative environments. Nevertheless much remains to be understood about the genetic basis of host plant adaptation. The cactophilic species of Drosophila that are found in South America have different degrees of divergence and specialization in the exploitation of the cactus they inhabit. The use of necrotic tissue as hosts has linked its evolutionary history to the expansion, contraction and diversification of cacti during climate changes promoted by Quaternary glacial periods. The sister species D. buzzatii and D. koepferae diverged about five million years ago and currently show a marked difference in life history traits, morphology and habit, which apparently have evolved as adaptations to different host plants. In its sympatric region located in northwestern Argentina, they alternatively use cardones (Trichocereus terscheckii) and prickly pears (Opuntia sulphurea) as breeding resources, where the primary host for one results in the secondary of the other. However, the host change seriously affects fitness components when both species are raised in the secondary resource, suggesting an important role of secondary metabolites in the process of ecological specialization. In this thesis, the genomics particularities of these sister species were studied, along with the genetic expression in different approaches to natural breeding conditions. From the results, differences arose between species, both in the genetic architecture as in the transcriptional modulation. Precisely, the biggest difference was found in transcriptional modulation carried out in the different breeding resources, although in both cases the differentially expressed genes were mainly related to detoxification, oxidation-reduction and response to stress, but also with development and neurobiological processes. This work contributes new data onto the role of transcriptional plasticity and the genomic bases of adaptive strategies to alternative rearing environments.

Author affiliation: De Panis, Diego Nicolás. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Comprender la relación entre la variación fenotípica y la genotípica ha sido y sigue siendo uno de los mayores desafíos de la biología moderna, ya que implica alcanzar una interpretación holística de la descripción de caracteres complejos y sus relaciones evolutivas utilizando de manera conjunta herramientas de la genómica funcional, la genética cuantitativa, la bioinformática y la genética ecológica. En insectos fitófagos el comportamiento de oviposición constituye un componente importante de la elección de hábitat. Dada la multiplicidad de factores genéticos y ambientales que parecen afectar su expresión fenotípica, el mismo puede definirse como un carácter complejo resultante de la participación de varios caracteres interdependientes. En esta tesis nos proponemos contribuir al conocimiento de la arquitectura genética del comportamiento de oviposición por medio del estudio genómico poblacional de dos caracteres complejos relacionados, la preferencia por el sitio de oviposición (PO) y la aceptación de recursos de oviposición (AO) en la especie modelo Drosophila melanogaster. Para cumplir con nuestros objetivos, cuantificamos la PO y la AO utilizando recursos que las moscas explotan como sustratos de cría en su hábitat natural: uva, tomate y naranja. Los resultados mostraron amplia variación fenotípica tanto de la AO como de la PO en todos los recursos y combinaciones de recursos ofrecidos. Para ambos caracteres, encontramos que la variación tiene una base genética y que su expresión depende del recurso (o combinación de recursos) ofrecido. En otras palabras se trata de caracteres cuya expresión depende del ambiente (plasticidad fenotípica). Posteriormente, realizamos análisis de asociación entre la variación fenotípica y la variación genética con el objetivo de establecer la arquitectura genética de la AO y la PO. Encontramos que la arquitectura genética de ambos caracteres es poligénica y que los genes que participan de su expresión se encuentran interactuando en redes génicas relacionadas con el desarrollo del sistema nervioso y del sistema visual. Finalmente, identificamos genes que actúan a través de los distintos niveles que conforman el mapa genotipo – fenotipo, presentando evidencia de su accionar en cada nivel por medio de los análisis de asociación entre la variación fenotípica y la variación a nivel transcriptómico. Podemos concluir, que a lo largo de la presente tesis hemos contribuido al estudio del comportamiento de oviposición, aportando evidencia de cómo se compone la arquitectura genética del mismo a través de los distintos niveles del mapa fenotipo-genotipo e infiriendo la importancia del comportamiento de oviposición en la historia evolutiva de D. melanogaster.

Understanding the relationship between the phenotype and the genotype is one of the biggest challenges in modern biology. It implies reaching a holistic interpretation of the description of complex traits and their evolutionary relationships using functional genomics, quantitative genetics, bioinformatics and ecological genetics tools. In phytophagous insects, oviposition behavior is an important component of habitat selection and given the multiplicity of genetic and environmental factors affecting its expression, it is defined as a complex character resulting from the sum of interdependent traits. In this thesis, we contribute to the knowledge of the genetic architecture of oviposition behavior by studying the population genomics of oviposition site preference (PO) and the acceptance for oviposition resources (AO) in the model species Drosophila melanogaster. First, we quantified the PO and AO by offering females grape, tomato and orange as breeding resources. Our results showed that phenotypic variation, in both traits, depends on the environment (phenotypic plasticity) and has a genetic basis. Next, we proceed to delineate the genetic arquitecture of PO and AO by performing genome wide association studies (GWAS). We found that the genetic architecture of both traits is enriched in many genes that participate in genetic networks related to development of the nervous and visual systems. Finally, we identify genes that are involved at different levels of the genotype – phenotype map by means of association analysis between phenotypic and transcriptomic variation. Our results are a contribution to the knowledge of oviposition behavior and its importance in the evolutionary history of D. melanogaster by successfully combining the study of variation across the genetic, transcriptomic and phenotypic levels.

Author affiliation: Betti, María Isabel Luján. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

El proceso de senescencia en plantas es un mecanismo complejo controlado por múltiples variables genéticas y ambientales que condicionan el rendimiento de los cultivos. En el caso del girasol, el segundo cultivo oleaginoso en importancia económica para nuestro país, se trata de un proceso con impacto económico que interviene en la brecha existente entre el rendimiento potencial y el rendimiento real observado, por la mayor o menor oportunidad de las plantas para mantener el sistema fotosintético activo durante periodos prolongados. Los parámetros visuales resultan tardíos para evaluar el desencadenamiento y posterior tasa de evolución de la senescencia foliar. La clorosis, la variación en el contenido de clorofila así como también la necrosis de las hojas, son detectables mucho tiempo después que la señal iniciadora de la senescencia ha sido activada. Este trabajo tuvo como objetivo general el estudio del proceso de senescencia en girasol a través de distintos niveles de organización: ecofisiológico, metabolómico, transcriptómico, culminando con la integración de los diversos enfoques ómicos mediante una aproximación de biología de sistemas, con el objetivo final de identificar potenciales biomarcadores asociados al proceso de senescencia en girasol. Se condujeron distintos ensayos que fueron realizados tanto a campo, en la Estación Experimental INTA-Balcarce como en invernáculo, en el Instituto de Biotecnología INTA Castelar, para evaluar el progreso del proceso de senescencia tanto en condiciones naturales como controladas. Asimismo se evaluó la respuesta frente a condiciones de restricción hídrica impuesta en distintas etapas del desarrollo de las plantas. Se realizaron evaluaciones ecofisiológicas relacionadas con el avance de la senescencia, a través de la medición de variables como contenido de clorofila, azúcares solubles y nitrógeno total de hojas, mediciones a campo de área foliar verde, SPAD, intercepción de la radiación y materia seca por órganos, mediante las cuales fue posible evaluar la evolución del proceso en las diferentes hojas, en condiciones naturales de cultivo. Adicionalmente, se llevó adelante un análisis de los perfiles metabólicos utilizando técnicas de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) que permitió la optimización del protocolo de la extracción de metabolitos de hojas de girasol, y la detección de aproximadamente 60 metabolitos primarios incluyendo distintos aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares y azucares alcohol. Asimismo se optimizó la tecnología de cromatografía iónica, mediante la cual se cuantificaron diferentes nutrientes iónicos relevantes durante el proceso de senescencia tales como nitratos, sulfatos, fosfatos entre otros. En forma paralela se llevó a cabo un estudio a nivel transcriptómico considerando tanto estrategias de genes candidato, mediante la búsqueda de secuencias putativamente ortólogas a girasol asociadas a senescencia en especies modelo, como el análisis concertado de expresión génica utilizando una micromatriz de oligonucleótidos desarrollada para esta especie. A partir del análisis estadístico de los datos obtenidos con la micromatriz, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional sobre el total de los unigenes que mostraron un comportamiento diferencial y significativo para las distintas condiciones evaluadas, utilizando la metodología de Gene Set Analysis basado en modelos de regresión logística. De este modo se identificaron las diferentes categorías funcionales asociadas a bloques de genes con un patrón de expresión similar. La búsqueda de genes candidato se profundizó con la consulta de bases de datos de genes asociados a senescencia (SAGs del inglés: Senescence Associated Genes), así como también sobre aquellos genes con dominios de factores de transcripción como posibles desencadenantes de las cascadas de señalización de este proceso. Por último, se realizó la integración de los datos obtenidos a partir de distintas estrategias (fisiológicas, metabolómicas y transcriptómicas) utilizando una aproximación basada en biología de sistemas con el objetivo de identificar biomarcadores asociados a la senescencia en girasol. Para este fin se usaron los programas Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (García-Alcalde y col 2011) y Mapman (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm y col 2004) que fueron adaptados para su uso con datos provenientes de esta especie. Los resultados obtenidos a partir de la integración de datos mostraron una correspondencia entre los cambios detectados a través de los diferentes niveles analizados. A partir de una visión general del metabolismo celular se pudo observar una disminución de la actividad fotosintética y el crecimiento celular, y un incremento en el metabolismo de sacarosa, ácidos grasos, nucleótidos y aminoácidos así como también en aquellos procesos relacionados al reciclado de nutrientes. En particular, los factores de transcripción con dominios NAC, AP2- EREBP y MYB mostraron altos niveles de expresión y mayores niveles de correlación y co-expresión, puntualizándolos como importantes biomarcadores candidatos para la ejecución del programa de senescencia en girasol. Los resultados de este trabajo permitieron contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en el desencadenamiento y evolución del proceso de senescencia en girasol, así como a la selección robusta de genes involucrados en las distintas etapas del desarrollo del proceso, especialmente factores de transcripción. Estos últimos fundamentalmente, podrán ser validados a futuro sobre materiales de mejora para ser incorporados a los programas de mejoramiento asistido de este cultivo de gran importancia agronómica para nuestro país. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven la adopción de la genómica y la post-genómica en las distintas etapas del mejoramiento de girasol.

Leaf senescence is a complex mechanism controlled by multiple variables, either from genetical and environmental origin that has strong impact on crop yield. In sunflower, the second economically important oil crop in Argentina, the senescence process has an economic impact involved in the gap between potential and real yield observed due to the incapacity of the plants in keeping their green leaf area for longer periods. Visual parameters are belated to assess the onset and the evolution of leaf senescence. Chlorosis, variation in chlorophyll content as well as leaf necrosis is detected long after the triggering signal has been activated. The main objective of this work was the study of the senescence process in sunflower through different organization levels: ecophysiological, metabolomic, transcriptomic, and finally an integration of the different omics strategies using a systems biology approach, in order to identify potential biomarkers associated to leaf senescence in sunflower. Different experiments were conducted in both, field and greenhouse condition at INTA-Balcarce Experimental Station and at the Biotechnology Institute, INTA Castelar respectively, assessing the senescence process under natural and controlled conditions. Response to water restrictions imposed at different plant development stages was also evaluated. Ecophysiological assessments related to the senescence progress were performed through different measurements such as chlorophyll, soluble sugars and total leaf nitrogen content, field measurements of green leaf area, SPAD, interception of radiation and dry material by organ, allowing the evaluation of the senescence process progression in different leaves growing under natural field conditions. Additionally, metabolic profiles analysis was performed by using Gas Chromatography - Mass Spectrometry technique (GC-MS), allowing the metabolite extraction protocol optimization in sunflower leaves and the detection of approximately 60 primary metabolites, including different amino acids, organic acids, sugars and sugar alcohol. Likewise, it was possible to optimize the ion chromatography technology, leading to the quantification of relevant ionic nutrients content such as nitrates, sulphates, phosphates and others, along the senescence process. In parallel, transcriptomic studies were performed considering both, candidate gene strategies by searching of sunflower orthologous gene sequences reported as senescence associated in model species, as well as through a concerted expression analysis using a customized oligonucleotide microarray developed for this species. Statistical functional enrichment analysis was conducted over the complete significant unigenes set derived from the microarray assay, for each evaluated conditions, using Gene Set Analysis methodology based on logistic regression models. In this way, different functional categories were identified for gene clusters with similar expression patterns. Moreover, the exploration for candidate genes was deepened by searching into the senescence associated gene databases for model species, as well as by identification of putative triggers of the signalling pathways leading to senescence in sunflower among the transcription factor domains gene database. Finally, a systems biology approach was achieved in order to integrate the information from the different physiological, metabolomic and transcriptomic strategies with the aim to identify biomarkers associated with leaf senescence in sunflower. These analyses were performed using Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (Garcia-Mayor et al 2011) and Mapman software (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm et al 2004) that were adapted for sunflower data. These results showed a correspondence between the changes detected by the different strategies. Through a metabolism overview, a decrease of photosynthetic activity and cell growth was detected. Moreover, sucrose, fatty acids, nucleotides and amino acids metabolism as well as those pathways related to nutrient recycling processes showed an up-regulation during leaf development. In particular, NAC, AP2-EREBP and MYB transcription factors showed high expression levels and higher levels of correlation and co-expression making them important candidates biomarker in the execution of the senescence program in sunflower. The results of this work contributed to the knowledge of the molecular mechanisms involved at the onset and evolution of the senescence process in sunflower as well as to the identification of robust candidate genes involved in the different developmental stages of this process, especially transcription factors. These genes could be further validated on breeding materials to be incorporated into assisted breeding programs for this agronomic important crop for our country. Furthermore, the strategies, methodologies, tools and knowledge developed in this thesis, contribute to the crop development and promote the adoption of genomics and post-genomics in the different stages of sunflower breeding.

Author affiliation: Moschen, Sebastián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Abstract:

Tesis para obtener el grado de Doctor en el área de Ciencias Biológicas, presentada en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires en 2014

El proceso de senescencia en plantas es un mecanismo complejo controlado por múltiples variables genéticas y ambientales que condicionan el rendimiento de los cultivos. En el caso del girasol, el segundo cultivo oleaginoso en importancia económica para nuestro país, se trata de un proceso con impacto económico que interviene en la brecha existente entre el rendimiento potencial y el rendimiento real observado, por la mayor o menor oportunidad de las plantas para mantener el sistema fotosintético activo durante periodos prolongados. Los parámetros visuales resultan tardíos para evaluar el desencadenamiento y posterior tasa de evolución de la senescencia foliar. La clorosis, la variación en el contenido de clorofila así como también la necrosis de las hojas, son detectables mucho tiempo después que la señal iniciadora de la senescencia ha sido activada. Este trabajo tuvo como objetivo general el estudio del proceso de senescencia en girasol a través de distintos niveles de organización: ecofisiológico, metabolómico, transcriptómico, culminando con la integración de los diversos enfoques ómicos mediante una aproximación de biología de sistemas, con el objetivo final de identificar potenciales biomarcadores asociados al proceso de senescencia en girasol. Se condujeron distintos ensayos que fueron realizados tanto a campo, en la Estación Experimental INTA-Balcarce como en invernáculo, en el Instituto de Biotecnología INTA Castelar, para evaluar el progreso del proceso de senescencia tanto en condiciones naturales como controladas. Asimismo se evaluó la respuesta frente a condiciones de restricción hídrica impuesta en distintas etapas del desarrollo de las plantas. Se realizaron evaluaciones ecofisiológicas relacionadas con el avance de la senescencia, a través de la medición de variables como contenido de clorofila, azúcares solubles y nitrógeno total de hojas, mediciones a campo de área foliar verde, SPAD, intercepción de la radiación y materia seca por órganos, mediante las cuales fue posible evaluar la evolución del proceso en las diferentes hojas, en condiciones naturales de cultivo. Adicionalmente, se llevó adelante un análisis de los perfiles metabólicos utilizando técnicas de cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GC-MS) que permitió la optimización del protocolo de la extracción de metabolitos de hojas de girasol, y la detección de aproximadamente 60 metabolitos primarios incluyendo distintos aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares y azucares alcohol. Asimismo se optimizó la tecnología de cromatografía iónica, mediante la cual se cuantificaron diferentes nutrientes iónicos relevantes durante el proceso de senescencia tales como nitratos, sulfatos, fosfatos entre otros. En forma paralela se llevó a cabo un estudio a nivel transcriptómico considerando tanto estrategias de genes candidato, mediante la búsqueda de secuencias putativamente ortólogas a girasol asociadas a senescencia en especies modelo, como el análisis concertado de expresión génica utilizando una micromatriz de oligonucleótidos desarrollada para esta especie. A partir del análisis estadístico de los datos obtenidos con la micromatriz, se realizó un análisis de enriquecimiento funcional sobre el total de los unigenes que mostraron un comportamiento diferencial y significativo para las distintas condiciones evaluadas, utilizando la metodología de Gene Set Analysis basado en modelos de regresión logística. De este modo se identificaron las diferentes categorías funcionales asociadas a bloques de genes con un patrón de expresión similar. La búsqueda de genes candidato se profundizó con la consulta de bases de datos de genes asociados a senescencia (SAGs del inglés: Senescence Associated Genes), así como también sobre aquellos genes con dominios de factores de transcripción como posibles desencadenantes de las cascadas de señalización de este proceso. Por último, se realizó la integración de los datos obtenidos a partir de distintas estrategias (fisiológicas, metabolómicas y transcriptómicas) utilizando una aproximación basada en biología de sistemas con el objetivo de identificar biomarcadores asociados a la senescencia en girasol. Para este fin se usaron los programas Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (García-Alcalde y col 2011) y Mapman (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm y col 2004) que fueron adaptados para su uso con datos provenientes de esta especie. Los resultados obtenidos a partir de la integración de datos mostraron una correspondencia entre los cambios detectados a través de los diferentes niveles analizados. A partir de una visión general del metabolismo celular se pudo observar una disminución de la actividad fotosintética y el crecimiento celular, y un incremento en el metabolismo de sacarosa, ácidos grasos, nucleótidos y aminoácidos así como también en aquellos procesos relacionados al reciclado de nutrientes. En particular, los factores de transcripción con dominios NAC, AP2- EREBP y MYB mostraron altos niveles de expresión y mayores niveles de correlación y co-expresión, puntualizándolos como importantes biomarcadores candidatos para la ejecución del programa de senescencia en girasol. Los resultados de este trabajo permitieron contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares involucrados en el desencadenamiento y evolución del proceso de senescencia en girasol, así como a la selección robusta de genes involucrados en las distintas etapas del desarrollo del proceso, especialmente factores de transcripción. Estos últimos fundamentalmente, podrán ser validados a futuro sobre materiales de mejora para ser incorporados a los programas de mejoramiento asistido de este cultivo de gran importancia agronómica para nuestro país. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven la adopción de la genómica y la post-genómica en las distintas etapas del mejoramiento de girasol.

Leaf senescence is a complex mechanism controlled by multiple variables, either from genetical and environmental origin that has strong impact on crop yield. In sunflower, the second economically important oil crop in Argentina, the senescence process has an economic impact involved in the gap between potential and real yield observed due to the incapacity of the plants in keeping their green leaf area for longer periods. Visual parameters are belated to assess the onset and the evolution of leaf senescence. Chlorosis, variation in chlorophyll content as well as leaf necrosis is detected long after the triggering signal has been activated. The main objective of this work was the study of the senescence process in sunflower through different organization levels: ecophysiological, metabolomic, transcriptomic, and finally an integration of the different omics strategies using a systems biology approach, in order to identify potential biomarkers associated to leaf senescence in sunflower. Different experiments were conducted in both, field and greenhouse condition at INTA-Balcarce Experimental Station and at the Biotechnology Institute, INTA Castelar respectively, assessing the senescence process under natural and controlled conditions. Response to water restrictions imposed at different plant development stages was also evaluated. Ecophysiological assessments related to the senescence progress were performed through different measurements such as chlorophyll, soluble sugars and total leaf nitrogen content, field measurements of green leaf area, SPAD, interception of radiation and dry material by organ, allowing the evaluation of the senescence process progression in different leaves growing under natural field conditions. Additionally, metabolic profiles analysis was performed by using Gas Chromatography - Mass Spectrometry technique (GC-MS), allowing the metabolite extraction protocol optimization in sunflower leaves and the detection of approximately 60 primary metabolites, including different amino acids, organic acids, sugars and sugar alcohol. Likewise, it was possible to optimize the ion chromatography technology, leading to the quantification of relevant ionic nutrients content such as nitrates, sulphates, phosphates and others, along the senescence process. In parallel, transcriptomic studies were performed considering both, candidate gene strategies by searching of sunflower orthologous gene sequences reported as senescence associated in model species, as well as through a concerted expression analysis using a customized oligonucleotide microarray developed for this species. Statistical functional enrichment analysis was conducted over the complete significant unigenes set derived from the microarray assay, for each evaluated conditions, using Gene Set Analysis methodology based on logistic regression models. In this way, different functional categories were identified for gene clusters with similar expression patterns. Moreover, the exploration for candidate genes was deepened by searching into the senescence associated gene databases for model species, as well as by identification of putative triggers of the signalling pathways leading to senescence in sunflower among the transcription factor domains gene database. Finally, a systems biology approach was achieved in order to integrate the information from the different physiological, metabolomic and transcriptomic strategies with the aim to identify biomarkers associated with leaf senescence in sunflower. These analyses were performed using Paintomics 2.0 (http://www.paintomics.org) (Garcia-Mayor et al 2011) and Mapman software (http://mapman.gabipd.org/) (Thimm et al 2004) that were adapted for sunflower data. These results showed a correspondence between the changes detected by the different strategies. Through a metabolism overview, a decrease of photosynthetic activity and cell growth was detected. Moreover, sucrose, fatty acids, nucleotides and amino acids metabolism as well as those pathways related to nutrient recycling processes showed an up-regulation during leaf development. In particular, NAC, AP2-EREBP and MYB transcription factors showed high expression levels and higher levels of correlation and co-expression making them important candidates biomarker in the execution of the senescence program in sunflower. The results of this work contributed to the knowledge of the molecular mechanisms involved at the onset and evolution of the senescence process in sunflower as well as to the identification of robust candidate genes involved in the different developmental stages of this process, especially transcription factors. These genes could be further validated on breeding materials to be incorporated into assisted breeding programs for this agronomic important crop for our country. Furthermore, the strategies, methodologies, tools and knowledge developed in this thesis, contribute to the crop development and promote the adoption of genomics and post-genomics in the different stages of sunflower breeding.

Instituto de Biotecnología

Author affiliation: Moschen, Sebastian. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina