Caracterización farmacológica y estudio de la relación estructura - Función del receptor nicotínico alfa 9

Authors
Verbitsky, Miguel
Publication Year
2001
Language
Spanish
Format
doctoral thesis
Status
Published version
Director/a de tesis
Elgoyhen, Ana Belén
Description
En este trabajo se presenta una extensa caracterización del receptor colinérgico nicotínico α9, utilizando el sistema de expresión heteróloga de ovocitos de Xenopus laevis. Durante la mayor parte del desarrollo del mismo se tuvo como hipótesis de trabajo que α9 sería la única subunidad integrante del receptor colinérgico nativo de las células ciliadas externas de la cóclea y de las células tipo II del aparato vestibular. Este receptor es responsable de la inhibición de la actividad de dichas células, mediada por la inervación colinérgica eferente coclear y vestibular. En 2001 se identificó y clonó una nueva subunidad de receptores nicotínicos, α1O. Esto condujo a modificar la hipótesis de trabajo, para incluir la posibilidad de un receptor heteromérico α9αl0 en las células ciliadas, pero sin excluir la posible existencia del receptor homomérico α9 en otros tipos celulares. La caracterización del receptor homomérico recombinante α9 incluyó el estudio de las propiedades farmacológicas del mismo. En particular, se demostró que a pesar que α9 es un miembro de la familia de genes de subunidades de receptores nicotínicos, el receptor no puede ser clasificado farmacologicamente como nicotínico o muscarínico y presenta un perfil farmacológico mixto, en coincidencia con lo reportado para el receptor nativo de las células ciliadas. Se mostró que tanto agonistas colinérgicos no específicos como la acetilcolina y el carbacol, agonistas nicotínicos como el metilcarbacol, la suberildicolina y el DMPP y agonistas muscarínicos como la oxotremorina - M, el metilfurtretonio y el McN-A-343 son capaces de activar al receptor α9. También la colina, un producto de degradación y precursor en la síntesis de la acetilcolina, activó al receptor α9. Notablemente, agonistas nicotínicos clásicos como la epibatidina, la nicotina y la citisina bloquearon al receptor α9 (IC50 : 1.6±0.l, 31.5±l.0 y 43.1±3.5 µM, respectivamente). Se estudió la sensibilidad de α9 a diversos antagonistas nicotínicos. En particular la metillicaconitina, un antagonista selectivo de receptores nicotínicos neuronales sensibles a la α-bungarotoxina, inhibió las respuestas de α9 a la acetilcolina en forma competitiva (IC50 : l.l±0.2 nM), siendo este el antagonista más potente de α9 hasta ahora reportado. Se demostró también que el receptor α9 es bloqueado tanto por agonistas como por antagonistas muscarínicos con el siguiente orden de potencia: atropina (IC50: l.0±0.1µM, ) ~ galamina (IC50: 1.5±0.2 µM) > pilocarpina (IC50: 76±9 µM) ~ muscarina (IC50: 84±6 µM) ~ betanecol (IC50: 105±14 µM), un rango de concentraciones comparable con las requeridas para el bloqueo producido por compuestos nicotínicos. Por otra parte, se demostró la inhibición de la respuesta a acetilcolina de los receptores α9 y α9α10 por morfina y péptidos opioides. Estos péptidos estarían presentes en la inervación eferente a las células ciliadas del aparato vestibular y modularían su actividad a través de su acción sobre α9αl0. Se demostró también que el receptor homomérico α9 es bloqueado por Ca++ extracelular (IC50: 100±10 µM a -70 mV), en forma dependiente del potencial de membrana. Este resultado es relevante para la fisiología de las células ciliadas. Mediante la construcción de una subunidad quimérica entre α9 y el receptor de serotonina de tipo 3A, se aportó evidencia de que el dominio aminoterminal de α9 es el determinante estructural de la interacción de α9 con agonistas y antagonistas. También se construyó una subunidad quimérica mediante el empalme de porciones de las subunidades α7 y α9. Los resultados obtenidos con las dos quimeras mencionadas, indican que los determinantes estructurales de la particular relación corriente - potencial de α9 (relacionada con la presencia de Ca++ extracelular), estarían confinados a la región que se extiende desde el comienzo del segundo segmento hidrófobo, supuestamente transmembranal, hasta el extremo carboxiterminal. Se identificó un residuo en el segmento hidrófobo M2 (Q261) involucrado en la rectificación de la corriente y en el bloqueo por el Ca++. En suma, el presente trabajo demuestra que el receptor α9 presenta una farmacología mixta nicotínica - muscarínica coincidente con la del receptor colinérgico de las células ciliadas. Esta coincidencia incluye también la sensibilidad de los receptores que contienen la subunidad α9 a péptidos opioides y a cationes divalentes. Por otro lado aporta evidencia de la importancia clave del dominio aminoterminal en determinar características farmacológicas de α9 y del segundo segmento hidrófobo en las propiedades del canal de los receptores α9 y α9α10.
This work provides an extensive characterisation of the α9 nicotinic acetylcholine receptor, making use of the Xenopus laevis oocytes heterologous expression system. As a working hypothesis during most of the process of this work, the α9 protein was thought to be the only subunit present at the native acetylcholine receptors of cochlear outer hair cells and type II vestibular hair cells. These receptors mediate inhibition of the activity of these cells by cholinergic cochlear and vestibular efferent innervation. In 200l α10, a new nicotinic subunit, was identified and cloned. This led to the modification of the previous hypothesis, in order to include the possibility of an heteromeric α9α10 receptor present in hair cells, not excluding the occurrence of homomeric α9 receptors in other cell types. The characterisation of the homomeric recombinant α9 receptor included the study of its pharmacological properties. It is demonstrated that although α9 is a member of the nicotinic receptor subunit gene family, the receptor cannot be pharmacologically classified either as nicotinic or muscarinic, since it displays a mixed pharmacological profile, in coincidence with what has been reported for the hair cells native receptor. It is shown that the α9 receptor is activated by the non-specific cholinergic agonists acetylcholine, and carbachol, as well as by the nicotinic agonists methylcarbachol, suberyldicholine and DMPP and the muscarinic agonists oxotremorine-M, methylfurthretonium and McN-A-343. Moreover choline, both a degradation product and a precursor of the synthesis of acetylcholine activates α9. Remarkably nicotinic agonists such as epibatidine, nicotine and cytisine blocked the α9 receptor (IC50 : 1.6±0.l, 31.5±l.0 y 43.l±3.5 μM, respectively). The sensitivity of α9 to various nicotinic antagonists is reported. Methyllycaconitine, a specific antagonist for α-bungarotoxin-sensitive neuronal nicotinic receptors, inhibited α9 acetylcholine-evoked responses in a competitive manner (IC50: l.1±0.2 μM), thus being the most potent α9 antagonist identified so far. It is also demonstrated that the α9 receptor is blocked by both muscarinic agonists and antagonists with the following rank order of potencies: atropine (IC50: l.0±0.1 μM) ~ gallamine (IC50: 1.5±0.2 µM) > pilocarpine (IC50: 76±9 µM) ~ muscarine (IC50: 84±6 µM) ~ betanechol (IC50: 105±14 µM), a concentration range which is similar to that required for the block by nicotinic compounds. It is also demonstrated that morphine and opioid peptides inhibit acetylcholine-evoked responses in α9 and α9αl0 receptors. These peptides are present at the efferent innervation to vestibular hair cells and would modulate their activity through their action on α9αl0. It is also demonstrated that the α9 homomeric receptor is blocked by extracellular Ca++ (IC50: 100±10 µM a -70 mV) in a voltage-dependent manner, a result relevant to hair cell physiology. By means of the construction of a chimeric subunit between α9 and the type 3 serotonin receptor, evidence is provided that the α9 aminoterminal domain is the structural determinant of the α9 interaction with agonists and antagonists. A chimeric subunit was also constructed by splicing portions of the α7 and α9 subunits. Results obtained with the aforementioned chimeras, indicate that the structural determinants underlying the peculiar α9 current-voltage relationship, are confined within the region that extends from the beginning of the putative transmembrane second hydrophobic segment, to the carboxiterminus. A residue (Q26l) within the the hydrophobic region M2 was identified as being involved in the rectification properties and in the block by Ca++. In summary, the present work demonstrates that the α9 receptor displays a mixed nicotinic-muscarinic pharmacology that matches that of the cholinergic receptor of cochlear and vestibular hair cells. The similarities between the native and the recombinant receptors extends to the sensitivity of the α9-containing receptors to opioid peptides and divalent cations. Evidence indicating the key importance of the aminoterminal domain in determining the α9 receptor pharmacological characteristics and of the second hydrophobic segment in the channel properties of the α9 and α9α10 receptors are also presented.
Fil:Verbitsky, Miguel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
Access level
Open access
License
http://creativecommons.org/licenses/by/2.5/ar
Repository
Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Institution
Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
OAI Identifier
snrd:Tesis_3338_Verbitsky