Caracterización bioquímica y molecular de la enzima UDP-glucosa: proteína transglucosilasa de Solanum tuberosum

Authors
Bocca, Silvia N.
Publication Year
1998
Language
Spanish
Format
doctoral thesis
Status
Published version
Director/a de tesis
Tandecarz, Juana S.
Description
La enzima UDP-glucosa: proteína transglucosilasa (UPTG) es una glicosiltransferasa autocatalítica descripta inicialmente en tubérculo de papa (Solanum tuberosum L.). Se había propuesto que la UPTG era capaz de iniciar la síntesis de α-glucanos unidos a proteína in vitro y que tendría una función de proteína iniciadora de la biosíntesis del almidón. La UPTG de tubérculo de papa se purificó hasta aparente homogeneidad, se desarrollaron anticuerpos policlonales específicos contra la misma y se clonaron cADNs correspondientes a la UPTG por screening de genotecas de expresión de papa. Ensayos de Northern blot y Western blot mostraron que tanto el ARN mensajero como la proteína UPTG están presentes en un nivel semejante en todos los tejidos de la planta. Algunas de las secuencias clonadas se expresaron en E. coli obteniéndose UPTG recombinante enzimáticamente activa. Se encontró que tanto las proteínas recombinantes como la purificada de tubérculo pueden ser glicosiladas a partir de UDP-Glc, UDP-Xil o UDP-Gal y que la glicosilación es reversible. Dos cADNs obtenidos fueron secuenciados totalmente, esto permitió detectar un muy alto grado de identidad (~ 90%) entre la secuencia de la UPTG y varias secuencias de proteínas vegetales de función aún no determinada que localizan específicamente en la región trans del aparato de Golgi. La secuencia de la UPTG no presenta zonas hidrofóbicas que puedan corresponder a regiones transmembrana ni un posible péptido señal que permita su entrada a plástidos o al sistema de endomembranas de la célula. Estos resultados sugieren que la enzima localizaría en el lado citoplásmico del aparato de Golgi y no en los plástidos en donde ocurre la síntesis del almidón, por lo tanto están en contra de un posible rol de la UPTG en la síntesis de este polisacárido. En ningún organismo que no sea vegetal se encontró una proteína que pueda considerarse homóloga a la UPTG. Esta característica, sumada a su localización indicarían una posible función relacionada con la síntesis de los polisacáridos complejos de la pared, función exclusiva del aparato de Golgi de las células vegetales. La especificidad de la UPTG por distintos nucleótidos azúcares y la reversibilidad de la reacción de glicosilación hacen pensar que la UPTG podría estar formando parte de un sistema complejo que acople el transporte de nucleótidos azúcares con la síntesis de polisacáridos estructurales.
The enzyme UDP-glucose: protein transglucosylase (UPTG) is an autocatalytic glycosyltransferase reported in potato tuber (Solanum tuberosum L.). It was suggested that UPTG could in vitro initiate protein-bound α-glucan synthesis and postulated as the protein that primes starch biosynthesis. UPTG was purified to apparent homogeneity from potato tubers, polyclonal antibodies were raised against the protein and cDNAs coding for UPTG were cloned screening potato expression libraries. RNA hybridization studies and Western blot analysis indicated that UPTG mRNA and polypeptide are expressed in all potato tissues. When the cloned sequences were expressed in E. coli, the recombinant UPTG was enzymatically active. It was determined that purified as well as recombinant UPTG can be glycosylated by UDP-Glc, UDP-Xyl or UDP-Gal and that glycosylation is reversible. The complete sequence of two cDNAs was obtained and compared with the sequences present in the databanks. UPTG shows a high degree of similarity (~ 90%) with several plant sequences. The function of these sequences remains to be determined but it was demonstrated their specific localization in the trans-Golgi cisternae. UPTG sequence do not present hydrophobic segments that could correspond to transmembrane regions. The amino terminal sequence lacks a signal peptide that could allow the protein to enter into plastids or into endomembrane system of the cell. These results suggest that the enzyme localizes at the cytoplasmic face of the Golgi apparatus, and not in plastids were starch synthesis occurs, and are against a possible role of UPTG in starch synthesis. In no organism other than plants a sequence homologous to UPTG could be detected. This fact, added to its Golgi localization suggests a role in cell wall polysaccharide synthesis, a function present exclusively in the Golgi apparatus of plant cells. The specificity of UPTG for different sugar-nucleotides and the reversibility of the glycosylation might correspond to UPTG being part of a complex system that couples sugar-nucleotide transport with the synthesis of cell wall polysaccharides.
Fil:Bocca, Silvia N.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.
Subject
ALMIDON
GLICOSILTRANSFERASA
GOLGI
POLISACARIDOS
SOLANUM TUBEROSUM L.
UDP-GLUCOSA: PROTEINA TRANSGLUCOSILASA
GLYCOSYLTRANSFERASE
GOLGI
POLYSACCHARIDE
SOLANUM TUBEROSUM L.
STARCH
UDP-GLUCOSE: PROTEIN TRANSGLUCOSYLASE
Access level
Open access
License
http://creativecommons.org/licenses/by/2.5/ar
Repository
Biblioteca Digital (UBA-FCEN)
Institution
Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
OAI Identifier
tesis:tesis_n3073_Bocca